银杏果表面病原真菌的分离鉴定及多样性分析的研究进展

1 前言

银杏（Ginkgo biloba L.）是世界上现存种子植物中最古老的孑遗植物。银杏果是除去外种皮后的种核，其富含蛋白质、氨基酸、脂肪等营养成分，及黄酮、内酯等有效成分，具有极高的经济价值。但是作为果蔬类，银杏果在采收时易受机械创伤、贮藏过程中低pH、高水分、高养分等特点，使其极易受真菌病害侵染，由此导致的腐烂会产生大量的真菌毒素，严重影响产品的最终消费^[1]。中国作为世界第一大果蔬生产国，产量约占全球总量的14%，但采后损失20%~30%。年均经济损失超过700 亿元^[2]，在有些发展中国家，采后损失甚至超过50%，而其中绝大多数是由病原菌侵染引起的^[3]，故受到研究者们的关注。根据调查，银杏果在贮藏中的主要问题是石灰化和霉腐，二者会降低其贮藏品质和商业价值。霉腐病发病率很高，果实之间还会发生交叉污染，且有些致病真菌可能会产生毒素类物质，残留在果实中，单纯清洗表面后也不能直接用于食品加工，对人体健康存在安全隐患。所以我们分离其表面病原菌，通过鉴定和多样性分析，找出关键致病菌，针对其进行防治，改善银杏果在贮藏过程中霉变腐烂的问题。

2 病原真菌种类

果蔬在贮藏过程中极易受到真菌侵染引起霉变，许多学者通过分离种皮表面的菌株找出致病菌，再进一步研究。大量调查发现，导致果蔬霉变的主要菌属为青霉属( Penicillium )，在目前已报道的约150种青霉属中，就有三分之一普遍存在于果蔬中，如指状青霉、变幻青霉、产黄青霉、朱黄青霉、意大利青霉、短密青霉等多种病菌，就是引起柑橘、苹果、梨等许多果蔬贮藏期病害的病原^[4-5]。朱从一等^[6]就在腐烂的柑橘果实上分离获得了皮落青霉(Pcrustosum)，接种该病原菌的温州蜜柑和纽荷尔脐橙均会发病，此外，指状青霉(P.disitatum)与意大利青霉(P.italicum)等青霉属病原菌也可以引起腐烂。在枣果的研究中，沙娜瓦尔等^[7]发现波兰青霉为优势菌种，分离频率最高、致病性较强，而其中变幻青霉为致病力最强的种，导致鲜果和干果的发病概率大大增加。也有研究者在银杏种子上鉴定出青霉菌属（Penicillium spp.）为主要侵染性病原菌^[8]，故将橘青霉（Penicillium citrinum）、蠕虫型青霉（Penicillium vermiculatum）、指状青霉（Penicillium digitatum）、展青霉（Penicillium patulum）接种并侵染银杏种子后，发现该种子呼吸强度(RI)、发病时间、表现的症状均有显著差异，并且不同程度地加速其失水与硬化^[9]。

3 病原真菌分离鉴定

3.1 分离

3.1.1 平板划线法

在微生物研究中，分离技术的使用较为普遍。最简单的分离方法之一是平板划线法，即用接种环沾取少许菌悬液，在无菌平板表面进行连续划线，通过划线次数的增加而使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落^[10]。

划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法是四格法，此方法只有第一次划线前取菌液，从第二次划线开始,每次划线的菌种均来自于上一次划线的末端^[11]。查慧^[12]用富集培养法将浓缩池污泥进行培养稀释，后用接种环一次挑出，用四格法反复划线进行分离纯化，最终分离获得产黄青霉等四种青霉菌属。彭翠珍等^[13]用采平板划线法，从活性污泥中分离获得21株纯菌株后，筛选出5株利用酿酒废水产絮凝剂活性较强的菌株进而研究。此方法可观察菌落特征，对混合菌进行分离，但是不能计数，故一般用于从菌种的分离纯化。

3.1.2 稀释涂布平板法

另一种常见的纯种分离方法是涂布平板法。将培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的菌悬液滴加在平板表面，再用玻璃棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。国外学者用稀释涂布法从土样中分离木霉菌，研究抗真菌试剂对木霉菌的生长的影响^[14]。李琳等^[15]经多次稀释涂布平板法纯化得到木霉菌株。此方法可以用于计数，但吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。故会用于平板培养基的回收率计数。

3.1.3 组织分离法

组织分离法一般用于植物中，以分离培养植物病原菌为目的，是植物病理学实验最基本的操作技术之一，也是病原形态观察、鉴定、植物病害接种体的培养等方面经常使用的研究手段，在学术报道中十分常见^[16]。席晓圆等^[17]就用此方法培养南方红豆杉近根部树皮组织，并分离出可产紫杉醇的内生真菌。陈小明等^[18]对该方法略作修改，取新鲜银杏根茎组织，分离出可产白果内酯的内生真菌。