草菇纤维二糖脱氢酶及其对纤维素糖化的影响

利用草菇纤维二糖脱氢酶( VvCDH )的天然信号序列，在毕赤酵母中成功表达了该基因，并进行了密码子优化。VvCDH最适pH值为5.5，最适温度为60℃，pH值稳定范围在5～8之间。动力学分析表明，纤维二糖是最佳底物，纤维寡糖的Km随底物长度的增加而增加。此外，乳糖也被有效氧化，但葡萄糖和麦芽糖是较差的底物。在纤维素底物水解过程中，在里氏木霉D - 86271酶解液中加入VvCDH，产生大量葡萄糖酸，提高了总水解率，表明VvCDH参与了纤维素酶糖化。VvCDH显示出与担子菌CDHs不同的酶性质，可以补充到里氏木霉纤维素酶混合物中用于商业应用。

1. 介绍

纤维二糖脱氢酶( CDHs，EC 1 . 1 . 99 . 18 )是多种木质纤维素降解真菌在纤维素分解培养条件下产生的胞外水解酶。它们与葡萄糖氧化酶、吡喃糖- 2氧化酶、吡喃糖脱氢酶等糖氧化还原酶同属葡萄糖-甲醇-胆碱( GMC )家族。CDHs是由一个N端细胞色素b型血红素结合结构域和一个C端菲芬结构域组成的单体蛋白，其中一个C端菲芬结构域由蛋白酶敏感的连接三羟基氨基酸连接。根据其推导出的氨基酸序列的系统发育分析，CDHs可分为两大亚类。ⅰ类CDHs序列较短，在C末端有一个结合结构域。担子菌CDHs是典型的ⅰ类成员。子囊菌属真菌的II类CDHs序列较长，可以( IIA类)或不( IIB类)含有C末端碳水化合物结合结构域。

CDHs可以催化纤维低聚糖的还原端氧化成相应的1，5 -内酯，然后水解成羧酸。除了纤维低聚糖外，CDHs对乳糖、葡萄糖等具有活性，但优选的底物是纤维二糖。同时，还原的CDHs被不同的电子受体如2，6 -二氯苯酚( DCIP )、细胞色素c ( cyt c )、包括Fe ( III )或Cu ( II )的金属离子和分子氧再氧化。迄今为止，CDHs的生物学功能尚不完全清楚，但以往的研究表明，CDHs在纤维素和木质素的酶水解中起着重要作用。CDHs可以作为一种通用的电子供体，用于裂解多糖单加氧酶( LPMOs )对生物质中纤维素和其他多糖的氧化攻击。还提出了CDHs提高纤维素酶活性，因为纤维二糖的氧化降低了最终产物的抑制。此外，CDHs由于其独特的催化和生物电化学性质，在生物催化、生物修复、酶生物燃料电池等生物过程中具有广阔的应用前景。CDHs已用于生物传感器检测细胞糊精、麦芽糖、乳糖、二酚类化合物和儿茶酚胺，并用于难降解污染物降解和纺织品染料脱色的生物修复。

草菇是一种可食用的草菇，具有完整的纤维素分解和半纤维素分解系统，参与纤维素、半纤维素和果胶的降解。本文合成了草菇纤维二糖脱氢酶( VvCDH )的密码子优化基因，并在毕赤酵母中表达。对VvCDH的生化特性进行了全面表征，并对其与纤维素糖化的关系进行了讨论。

2. 材料和方法

2.1. 微生物菌种及培养条件

巴斯德毕赤酵母gs15来源于Invitrogen (美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)，并保存在YPD平板上( 10g / L酵母提取物，20g / L蛋白胨，20g / L葡萄糖，1.5 - 2.0 %琼脂)。将所有酵母转化体保持在YPDZ平板(含有100mu;g / mL泽罗辛的YPD平板)上。里氏木霉D - 86271 ( Rut C - 30 )是由芬兰VTT培养物保藏中心( VTTCC )提供的，用于生产粗纤维素分解酶。采用PDA培养基(马铃薯200 g / L，葡萄糖10g / L，琼脂15g / L )对里氏木霉D - 86271进行产孢和保藏。根据Long等人的研究，改良的曼德尔氏培养基已经制备好。[ [ 28 ]并用于生产里氏木霉D - 86271的粗纤维素分解酶。所有其他化学品均为分析级，可商购。2.2 . VvCDH的异源表达和纯化。