研究目的及意义

木质纤维素生物质的预处理过程中会生成多种醛类副产物，其对微生物的生长起到了抑制作用。所以人们开始寻找可以代谢这些醛类副产物的微生物，主要是将糠醛和5-羟甲基糠醛等醛类物质分别还原成为糠醇和2,5-呋喃二甲醇等醇类物质。有研究表明，是这些化合物苯环上功能性的醛基对发酵微生物细胞生长具有毒性，而并不是呋喃环本身。因为已有研究显示，很多种具有呋喃环的有机物并不对微生物细胞具有毒性。近年来，国内外很多学者对微生物降解糠醛及其衍生物的特性进行了研究，这些研究主要集中在两方面：一方面对废水中的糠醛，5-羟甲基糠醛及含纤维素生物材料水解液中的糠醛及5-羟甲基糠醛进行降解，以进行脱毒；另一方面，对糠醛，5-羟甲基糠醛及其他衍生物进行生物转化，以获得有用的代谢产物^[1]。糠醛及其衍生物由于含有呋喃环，不易受到代谢过程的破坏，表现出难以生物降解性能。例如，以低毒性的糠酸为唯一碳源和能源驯化培养出的菌株，能够降解糠醛和糠醇。糠醛，5-羟甲基糠醛及其他衍生物生物降解的途径包括好氧降解，厌氧降解，共代谢降解，混合菌群降解等，通过菌株的筛选和选育，将适合的菌种利用起来，从而更好的得到还原产物研究发现，一旦将这些醛基转化为毒性较弱的醇的形式，就可以减少其对微生物的毒害^[2]。所以，通过筛选和选育出的菌株能够跟好的降低糠醛及5-羟甲基糠醛转化为醇的毒性的毒性，从而提高产品的产量及质量。本实验在兼性厌氧条件下筛选并选育出一株新的菌株，将糠醛及5-羟甲基糠醛还原成醇类，为有效降低木质纤维素预处理后醛类毒性的研究提供基础。

国内外研究现状

2.1醛类物质对微生物生长的影响和耐受机理

木质纤维素生物质的预处理过程中会生成多种醛类副产物其中，糠醛(学名吠喃甲醛)是以农林废料(玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣、木材碎屑)等为原料,经水解、精制而得,是重要的化工原料,主要用于铸造、化工、石油、医药、农药等部门^[13]。它对于化工的发展有着积极的作用，对于这方面的研究人们越来越注重。目前，虽然可以采取驯化或诱变等手段随机选育出糠醛耐受性菌株，但是菌株耐受糠醛的机制却一直不清晰。掌握微生物对糠醛的耐受机制，有助于科学设计基因改造路线，从分子水平定向改造微生物细胞，提高微生物细胞对糠醛的耐受性，有助于从根本上解决糠醛对微生物的抑制问题。另外研究表明5-羟甲基糠醛化学催化仍是高值化转化的主流方法^[14]。尽管化学法已取得了长足进展，但化学法通常以重金属为催化剂，环境不友好。此外，部分化学催化剂选择性不理想，容易导致活性羟基或醛基的过度氧化，从而产生大量副产物，影响后续目标产物分离纯化，而与化学法相比，生物催化具有诸多优势，如反应条件温和、选择性高、工艺简单、无需利用有毒溶剂和催化剂，环境友好。生物催化替代传统的化学工艺已成为未来工业制造的发展趋势。而更多的研究也将使5-羟甲基糠醛得发展得到极大的提升。

2.1.1 耐受醛类微生物机理

木质纤维素类生物质的细胞壁主要由木质素、纤维素和半纤维素构成，须经过一系列预处理过程如酸或碱处理，才能被高效糖化利用。前处理过程能破坏木质纤维素原料结构的顽抗性以提高底物的酶解可及性，但同时也不可避免地生成呋喃及其衍生物、酸类、酚类等抑制物，严重阻碍了微生物的生长和后续发酵过程。这些抑制物主要有三大类：弱酸类（甲酸、乙酸等）、呋喃醛和酚类化合物。通过微生物菌株可以降解糠醛及5-羟甲基糠醛等呋喃醛类物质，糠醛降解路径总体为：糠醛依次经过糠醇和糠酸降解为氧代戊二酸，氧代戊二酸进入 TCA 循环被降解^[3]。5-羟甲基糠醛则是一种重要的化工原料，它的分子中含有一个醛基和一个羟甲基，可 以通过加氢，氧化脱氢，酯化，卤化，聚合，水解以及其它化学反应，用于合成许多有用化合物和新型高分子材料。5-羟甲基糠醛分子上的醛基加氢还原生成羟甲基是一个相对容易的过程，但是在实际加氢过程中，产物分子上的两个羟甲基可以进一步氢化生成甲基或是甲烷，呋喃环上的双键也可以被饱和，生成四氧咲喃环化合物。KOENIG 等最早提出糠醛氧化成糠酸，糠酸继续降解成氧代戊二酸，氧代戊二酸进入 TCA 循环。这个观点受到大多数学者的认同。微生物对糠醛的耐受是一个非常复杂的生物学过程，总体包括两方面：一是微生物降解转化糠醛；二是微生物形成自我保护机制，修复糠醛给微生物带来的损伤，调节生物合成与能量代谢，响应糠醛的胁迫。相对于原始醛类物质依赖糖酵解和糖异生抵抗胁迫，耐受醛类物质能通过较低的氨基酸代谢、核苷酸代谢和较高的能量代谢，使本身具有更强的耐受能力；糠醛抑制糖酵解途径，导致 ATP 缺乏，另糠醛转化也要消耗一定能量和氧化还原酶及其辅酶，对此耐受酵母上调参与电子传递/能量合成和酶表达的相关基因。许多学者采用不同方法从不同角度研究糠醛对微生物的影响，并对比糠醛耐受菌株和普通菌株响应差异以探究微生物耐受糠醛的机制。

微生物对醛类产物的耐受是一个非常复杂的生物学过程，总体包括两方面：一是微生物降解转化醛类物质；二是微生物形成自我保护机制，修复醛类物质给微生物带来的损伤，调节生物合成与能量代谢，响应醛类物质的胁迫^[15]。相对于原始醛类物质依赖糖酵解和糖异生抵抗胁迫，耐受醛类物质能通过较低的氨基酸代谢、苷酸代谢和较高的能量代谢，使本身具有更强的耐受能力；醛类物质抑制糖酵解途径，导致 ATP 缺乏，另醛类物质转化也需要消耗一定能量和氧化还原酶及其辅酶，对此耐受酵母上调参与电子传递/能量合成和酶表达的相关基因。研究表明醛不仅会改变细胞及细胞器形态，造成胞内活性氧积累，使细胞从基因表达到转录再到蛋白质翻译都发生了显著的变化。醛类物质还会破坏细胞内氧化还原平衡，微生物耐受醛类物质能力与恢复或调整胞内氧化还原平衡有关^[16-17]。如果微生物能够越快恢复或者能够重新调整氧化还原平衡使之适应醛类物质的存在，那么该微生物耐受醛类物质的能力越强。越来越多关于这方面的研究将会促使我们对于这一领域有着更深的了解。近年来，越来越多的学者致力于微生物耐受醛能力方面的研究，使得微生物对于醛类的抗性进一步加强，大大促进了这一领域的发展。

2.1.2耐受醛类微生物

在木质纤维素的预处理过程中会生成许多醛类副产物，这时候便需要选出耐受醛类微生物的菌株来参与代谢这些醛类副产物。从皂素废水中同样能够筛选到耐受醛类微生物的菌株，比如从皂素厂污水处理池的活性污泥中分离出一株菌株DS1，经鉴定为蜡样芽孢杆菌属，DS1能够以糠醛为唯一碳源进行生长，糠醛耐受浓度高达 4 g/L^[4-5]。此外，不少学者也尝试采用共生方式来培养微生物，以达到在含有糠醛的水解液中生长且高效率发酵的目的。

双歧杆菌属也常用于做筛选的菌株，双歧杆菌无芽抱、英膜和鞭毛，是革兰巧阳性菌；菌落质地柔软、光滑凸圆边缘整齐，呈乳白或者白色株。双歧杆菌要发挥其对于宿主的各种生理功能需要保持很髙的活菌数，但外界环境因素会影响其活菌数。双歧杆菌细胞内积累过多的活性氧会限制其益生功能的发挥。不同双歧杆菌对于氧的耐受性是不同的，通过双歧杆菌的厌氧性，能够更好在兼性厌氧条件下筛选出耐受醛类的菌株^[6]。

芽孢杆菌属也是重要来源之一，芽孢杆菌是能形成芽孢的杆菌或球菌，属于革兰氏阳性菌，包括嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌。其对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。利用芽孢杆菌来筛选菌株具有很大的优势，它的成本较低，对营养成分要求较低，芽孢杆菌较为耐高温，可以再更多的条件下进行^[7]。这些菌株对于醛类副产物的代谢具有重要的意义，这些菌株有利于成本的降低，产品代谢的效率，使醛类副产品转化为醇类产品的转化率得到巨大的提高。