1.研究目的及意义

糖苷酶即糖苷水解酶，是一类水解糖苷键的酶，在生物体糖和糖缀合物的水解与合成过程中扮演着重要角色。而酶法糖基化具有高度的区域及立体专一性，能够实现高选择性的糖苷化合物的合成。这类酶包含糖基转移酶和糖苷水解酶，糖基转移酶以核苷磷酸糖基为供体（例如UDP-Glu）转移糖基至受体上，由于活化糖基价格昂贵而限制了该酶在糖苷化合物大规模制造中的应用。糖苷酶水解酶可以用廉价的寡糖作为糖基供体，并具有较广泛的糖苷配基特异性，是糖苷化合物产业化制备的首选催化剂，因此，利用糖苷酶的催化合成技术才可能实现糖苷化合物的低成本制备。糖苷酶除了不需要活化的核苷糖作为供体外，另一优势是较广泛的糖苷配基特异性，其催化活性中心往往具有较大的空穴，可以容纳多种结构类似或差异底物，对多种底物的催化活性显著不同。前期实验中，来源于保加利亚乳杆菌beta;-半乳糖苷酶及凝结芽孢杆菌beta;-半乳糖苷酶表现出不同的转糖基活性，课题在此基础上研究其酶学性质和空间结构差异，为后期应用奠定基础。

2.文献综述

2.1 beta;-半乳糖苷酶概述

beta;-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.23)又称乳糖酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，它能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖。某些种类的beta;-半乳糖苷酶在水解乳糖分子中beta;-1，4半乳糖苷键的同时，还具有转半乳糖基作用，以乳糖或其水解产物半乳糖和葡萄糖为糖基受体，合成半乳糖苷键，生成低聚半乳糖^[1]。不同微生物来源的beta;-半乳糖苷酶的水解活性和半乳糖基转移活性的比例不同。某些微生物，如Kluyveromyces lactis，K. fragilis，Aspergillus niger等所产生的beta;-半乳糖苷酶具有较强的水解活性；而某些微生物，如Lactobacillus bulgaricus，Streptococcus thermophilus，Aspergillus oryzae，Bacillus circulans，Bifidobacterium sps.等所产生的beta;-半乳糖苷酶则具有较强的半乳糖基转移活性。^[2]

2.2 beta;-半乳糖苷酶来源及性质

2.2.1 beta;-半乳糖苷酶来源

beta;-半乳糖苷酶广泛存在于各种动物、植物以及微生物中。beta;-半乳糖苷酶的主要来源有：①细菌、霉菌、酵母菌等微生物，如：细菌中的乳酸菌、大肠杆菌，霉菌中的米区菌、黑曲菌，酵母中的脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母，放线菌中的天蓝色链霉菌；②植物，尤其是杏、扁桃和苹果；③哺乳动物，特别是幼小哺乳动物的小肠中。目前，仅来源于微生物的beta;-半乳糖苷酶有工业应有价值，商业用酶源一般认为酵母(如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母)最为安全，其次为黑曲霉。^[3,4]

2.2.2 beta;-半乳糖苷酶的性质

beta;-半乳糖苷酶根据不同来源可分为胞内酶或胞外酶^[5]， 如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根酶等产beta;-半乳糖苷酶均为胞外酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌产胞内酶。霉菌作用最适 pH 偏酸性（pH2.5-5.0），酵母和细菌所产beta;-半乳糖苷酶最适 pH 近中性(分别为 pH 6-7 和 pH6.5-7.5) ^[6]，因此，最适 pH 决定了各自的用途，如霉菌所产beta;-半乳糖苷酶适用于酸性乳清和干酪的水解(含大量乳糖) , 酵母和细菌beta;-半乳糖苷酶适于牛乳( pH6. 6) 和鲜乳清 ( pH 6. 1) 的水解。

微生物beta;-半乳糖苷酶最适作用温度范围较宽， 酵母beta;-半乳糖苷酶作用温度在 35℃左右, 而霉菌最适作用温度一般在 50 ℃以上, 最高可达 60 ℃, 环状芽抱杆菌则可达 65℃ , 嗜热水生菌则为 80 ℃, 耐高温微生物菌株使用时可避免杂菌污染。^[7,8]

beta;-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶，存在多种微生物来源，除了水解活性，某些来源的beta;-半乳糖苷酶也具有转糖基活性。来源不同的酶具有不同的特性，例如酶的最适 pH，最适温度，动力学常数Km会有所区别。此外，酶的来源不同，如克鲁维酵母、曲霉、芽孢杆菌、链球菌和隐球菌属和不同的反应条件，如温度和 pH，酶反应合成低聚半乳糖的聚合度、产率及形成糖苷键的类型也不同。目前beta;-半乳糖苷酶应用的研究热点主要集中在固定化、生产低聚糖和使用基因工程技术生产乳糖酶等方面^[9]。

2.3 beta;-半乳糖苷酶的催化机理

早期研究表明，beta;-半乳糖苷酶水解乳糖至少有3个步骤，最后一个步骤表现为水解或转移活力，即 ：(1)酶 乳糖→酶-乳糖

(2)酶-乳糖→半乳糖基-酶 葡萄糖

(3)半乳糖基-酶 受体→半乳糖基-受体 酶