前言

随着各国工业化程度的提升和世界人口激增，能源消耗持续上升，化石资源日益匮乏，所带来的能源危机问题日益成为了全球关注的焦点。生物乙醇作为可再生能源，清洁可再生，是一种理想的石油替代品，对于保障能源安全具有重要的战略意义。生产燃料乙醇的原材料丰富，目前全球范围内可以用来作为生产燃料乙醇的原料分为淀粉类、糖料类和木质纤维素类。以淀粉发酵生产燃料乙醇成本高，而相对于淀粉类和糖类原料，植物纤维原料属于非粮原料且资源丰富，因此以植物纤维原料为原料生产燃料乙醇具有很好的研究前景。

木质纤维素中约30%为半纤维素，而木糖是半纤维素的主要组成成分。在自然界中的丰富程度仅次于葡萄糖。可见，木糖的有效利用是木质纤维原料发酵生成乙醇的关键。采用生物技术将植物纤维转化成乙醇，主要有三方面:原料预处理、纤维素酶制备及酶水解、己糖和戊糖的同步乙醇发酵^[1]。

酵母是乙醇发酵的主体。固定化酵母细胞可以长时间稳定的反复利用，同时减少发酵中受杂菌污染的机率。这种工艺的优点在于:酵母不必回收利用，省去离心设备，简化了工艺;酵母一直处于增殖状态下，发酵活力较高;载体仅用于酵母的固定化，材料用量少、要求低、费用低，在工业化生产上有较大的可行性。

在长期的研究和实践中，人们发现微生物之间能保持共生、互生或拮抗关系。根据微生物之间的这种相关性，将代谢类型不同的微生物适当组合进行混合协同培养，具有纯种培养所没有的优点，如可获得更高的产率和生长速率，能利用廉价不纯的底物，提高菌种抵抗感染的能力等^[2]。微生物混合培养在发酵生产Vc、单细胞蛋白，及废水处理中已经得到了广泛的应用，已经越来越为人们所重视，逐渐被引入到其他物质如酒精发酵技术中。

2.文献综述

2.1戊糖发酵

2.1.1戊糖发酵微生物

木糖过去一直被认为不能被微生物发酵成酒精。直到1980年Wang等人提出，木糖可被一些维生物发酵成酒精^[3]。此后在国际上掀起了一股木糖酒精发酵菌种的研究热潮，迄今为止已发现一百多种微生物能代谢木糖成酒精，包括细菌、真菌和酵母。

代谢木糖产生乙醇的细菌种类很多，除了能发酵单糖外还能发酵纤维素、生物高聚糖等，但细菌在发酵中会产生副产物且乙醇得率低，同时在高pH条件下容易引起杂菌污染等。酒精发酵能力最强的细菌是Zymomonas mobils，但它只能发酵葡萄糖、果糖和蔗糖，而不能发酵木糖。在具有戊糖发酵能力的细菌中，Clostridium thermohydrosulfuri 39E发酵木糖的能力最强，酒精得率达0.39g/g(酒精/消耗的糖)。Lynda等发现一株极端嗜热的产乙醇细菌(Ther- moanerobacter ethanolicus)可在680高温下采用连续培养法转化木糖获得乙醇，其得率可达 0.144g/g。丝状真菌中能利用木糖产乙醇的菌种较少，相关研究不多。真菌不仅能发酵单糖，而且还能发酵二糖、纤维素和木聚糖，真菌的这种性质特别适合于植物 纤维原料的同步糖化发酵，在实验室中已经筛选出具有同步糖化发酵能力的真菌有粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)等。丝状真菌能产半纤维素酶和纤维素酶，适于植物纤维原料的同步糖化发酵。在戊糖发酵的微生物中，酵母的戊糖发酵能力最强。与细菌的乙醇发酵相比，酵母菌具有酒精转化率高、得率高、酒精耐受能力高、副产物少、发酵过程不易污染等优点。酵母菌中可发酵木糖产乙醇的菌有:嗜鞣管囊酵母 (Pachysolen tannophilus)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、酒香酵母(Brettanomyces anomalus)和产朊假丝酵母(Candida utilis)等。宋安东等曾用嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)对木糖和葡萄糖混合液共发酵生产燃料乙醇，发酵过程中糖利用率较高，发酵过程中先利用葡萄糖，在葡萄糖利用完后再利用木糖。菌体生长和乙醇产生随发酵时间延长而改变，发酵醪液中乙醇浓度为2%^[4]。近年来许多研究者构建了可以同时高效代谢五碳糖和六碳糖的基因重组菌，对纤维质乙醇发酵的转化率有很大提高^[5-6]。

2.1.2戊糖发酵机理

发酵五碳糖产乙醇的机理研究主要集中在木糖的发酵机理上。目前为止，微生物妆化木糖成乙醇的途径主要有两条，表现在木糖转换成木酮糖途径上的差异：一是在某些利用木糖的酵母及丝状真菌中，需要经过两步氧化还原反应将木糖转化为木酮糖。首先经依赖于NAD(P)H的木糖还原酶（Xylose reductase，XR）作用还原为木糖醇，然后由依赖于NAD 的木糖醇脱氢酶（Xylitol dehydrogenase,XDH）作用脱氢为木酮糖；二是在大多数能利用木糖的细菌中，木糖通过木糖异构酶的作用经过一步反应直接转化为木酮糖，该酶不需要辅酶的参与。木糖转化为木酮糖后，通过木酮糖激酶（Xylulokinase，XK）磷酸化生成5-磷酸木酮糖进入磷酸戊糖途径（Pentose phosphate pathway，PPP），经过一系列反应生成3-磷酸甘油酸和6-磷酸果糖，再通过糖酵解途径或ED途径生成丙酮酸，在厌氧的条件下经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶作用转化成乙醇^[7]。

由于酵母代谢木糖的途径比代谢葡萄糖复杂得多，在代谢过程中部分木糖没有转化成酒精而进行辅酶NADPH的合成或转化成其它副产物，因此，酵母代谢木糖的理论得率为0.46g/g(酒精/消耗的糖)，低于己糖酒精发酵理论得率0.5lg/g(酒精/消耗的糖)^[5]。

2.2固定化细胞技术

2.2.1固定化细胞的方法

所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的细胞或酶，定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。固定化细胞既可以提高生产效率和生产能力 延长生产周期 又易于细胞的分离和回收。与游离细胞发酵相比较，固定化细胞技术具有显著的优势，它不仅细胞密度高，反应速度快，而且细胞损失少，反应易控制，固液容易分离，还可以对温度、有机溶剂等具有较强的耐受能力^[8-9]。固定化细胞的制备方式是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。一般来说大致可以分成吸附法、包埋法、共价结合法和交联法4大类，其中以包埋法使用最为普遍。