大豆平头炭疽和梨胶孢炭疽及其遗传转化体系的研究进展

摘要: 真菌中的炭疽一属在植物生产中导致了巨大的经济损失,现今国内对炭疽病菌的研究主要集中于生物学特性､化学药剂筛选一类方面,而关于其遗传多样性､致病相关基因等报道较少,限制了防治该病技术的发展｡目前,国外学者开展了大量有关炭疽菌致病基因的研究｡近年来多种炭疽菌属真菌的基因组序列的揭示为开展炭疽分子病理学研究提供了基础,笔者认为可以通过构建农杆菌介导炭疽菌建立遗传转化体系,获得高效的转化体系,来作为促进日后基因定点敲除的基础｡

关键词: 平头炭疽; 胶孢炭疽; T-DNA转化; 根瘤农杆菌转化

炭疽属真菌,长久以来经济生产中的一大不利因素｡由平头炭症菌侵染引起的大豆炭症病,是世界上大豆产区的重要病害之一,可造成大豆严重减产 (赵胜等,2016)｡近几年,胶孢炭疽菌引发的梨炭疽病已成为砀山县及周边地区梨树的主要病害 (沈静霆,2012)｡为了阻止它,全球的炭疽菌研究者绞尽脑汁,不断获得新的发现｡比如:根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化是近年建立起来的一种新方法,和以往的真菌转化体系相比具有转化方法简单､材料易得､效率高以及转化子中T-DNA单拷贝插入比例高的特点(黄亚丽等,2007)｡需要探明农杆菌介导以上两种炭疽菌建立遗传转化体系的特性,获得高效的遗传转化体系,或许可以作为促进日后基因定点敲除的基础｡

大豆炭疽病是影响大豆生产的重要病害之一, 在我国东北､华北､华东､西北､华南各大豆产区均有发生｡大豆的整个生育期均可发病,苗期可引起死苗,成株期危害茎秆､豆荚,导致产量降低､鲜荚商品性状下降,品质变劣｡平头炭疽菌（Colletotrichum truncatum( Schwein. ) Andrus amp; W. D. Moore）是引起大豆炭疽病的主要病原之一,而分生孢子是其无性繁殖的基本单位,获得足够量的分生孢子是开展真菌致病机理以及寄主病理学研究的重要基础｡目前,关于大豆炭疽病营养生理､生物学特性等的研究已有少量报道,钟荣顺等研究10种碳源及11种氮源对大豆炭疽病菌菌丝生长的影响,结果表明病原菌对不同碳源､氮源的利用程度存在显著差异;汪涛等的研究结果表明,葡萄糖作碳源时菌丝生长最快,果糖作碳源时菌丝干重达到最大;孙志峰等也较为系统地研究了光照､温度､pH值､湿度以及碳氮源等对大豆炭疽病菌菌丝生长､产孢及分生孢子萌发的影响｡但如何获得大量的分生孢子,还未见系统报道｡为此,赵胜等在对湖北省大豆炭疽病病原菌分离鉴定的基础上,研究了不同因素(培养基类型､光照条件､培养温度､蔗糖浓度等) 对大豆炭疽病菌产孢量的影响,在供试的4种培养基中,该菌产孢量在燕麦培养基上最高, 之前人门较多采用查氏培养基和PDA培养基,而他们发现查氏和PDA培养基虽然能使炭疽产孢,但产量很低,不能满足大规模鉴定或其他基础研究的需要｡本试验得出最佳培养基为燕麦培养基,这在大豆炭疽菌研究中未见报道,原因可能是燕麦培养基中的养分相比PDA､玉米培养基要少,其营养成分配比可能更适宜大豆平头炭疽菌产孢｡光照条件 对炭疽产孢的影响不明显,这与孙志峰等认为光照对病原菌菌丝生长的影响较小､而产孢量具有极显著差异的研究结果有所不同,分析其原因:一是不同菌株的生长特性不同,或菌株对光照的敏感程度不同;二是病原菌培养基成分､培养 pH､温度､碳源浓度等条件不同所导致的;温度对菌丝的生长速度有显著影响,但对产孢量没有显著的影响;此外,在 本实验中我们还发现,燕麦培养基中过高的蔗糖浓度并不利于大豆平头炭疽菌产孢量达到最大,以往的研究多集中在碳源的种类上,但对最佳蔗糖浓度的研究却未见报道｡

近几年,由于气候异常､菌源积累､栽培管理粗放､病虫防治技术不到位等各方面因素影响, 梨炭疽病已成为砀山县及周边地区梨树的主要病害, 严重威胁着梨生产｡但相关研究内容深度和广度都不足够,为此,沈静霆通过试验测定梨炭疽病菌rDNA 全序列,对比梨炭疽病菌和其它炭疽菌ITS序列以及构建系统关系树,发现梨炭疽菌与胶孢炭疽菌ITS1序列的相似性极高,达99.0%~100%,明确了梨炭疽病菌属于胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides),并发现梨炭疽病菌菌丝在10~35℃范围内均能生长,22~30℃菌丝生长良好,最适生长温度为28℃｡20~30℃范围内分生孢子萌发良好｡其中以25℃时萌发率最高,28℃时芽管伸长最适｡分生孢子致死温度为49℃,10min｡pH 值4~11之间均可营养生长,适宜菌丝生长的pH范围为5~8,最适pH为6.7｡pH值5~9之间的分生孢子萌发良好,且差异不显著｡最适宜孢子萌发pH为6~7｡梨炭疽病菌对不同碳源的利用程度不同｡其中对 Dshy;甘露糖､麦芽糖和果糖的利用率最高; 葡萄糖､蔗糖和山梨醇次之;以甘油和乳糖作为碳源时,菌落直径小于对照组,且菌落稀薄,不能被利用｡

胶孢炭疽菌( Colletotrichum gloeosporioides ( Penz. ) Penz. et Sacc. ) 可以侵染诸如桃､核桃､板栗､芒果､柿树､枇杷､苹果､橡胶､阿月混子､南方红豆杉､砀山梨等众多重要的经济林树种,也可侵染蒜薹､番木瓜､麦冬等植物,引起生产上较为严重的炭疽病, 严重威胁着各国林业生产｡对此,韩长志提出国内对炭疽病菌的研究主要集中在生物学特性､化学药剂筛选等方面,而关于其遗传多样性､致病相关基因等报道较少,并指出这在一定程度上限制了对其侵染过程和致病机制的深入认识,从而限制了防治该病技术的发展｡目前,国外学者开展了大量有关胶孢炭疽菌的致病基因的研究,胶孢炭疽菌侵染过程中众多阶段相关的致病基因已经得到克隆,例如,孢子附着基质基因chip1､附着孢形成时期的cap3､cap5､cap20､cap22､CUT1以及chip6基因;持家基因有TUB1和 TUB2;营养阶段有关的基因gln和CgDN24;早期活体营养阶段CgDN3基因;死体营养阶段的pel､pelB以及转录激活基因CGTA1｡同时,有报道显示编码beta;-微管蛋白的基因 tub1､tub2与多菌灵抗药性产生有关, CgOpt1编码寡肽转运器以及CgCTR2编码液泡铜转运器均与病原菌的致病性相关,然而,上述众多基因是如何行使各自功能,共同侵染植物以及产生对药剂抗药性机制尚不清楚,因此,从信号网络视角开展胶孢炭疽菌各基因功能的研究对于进一步明确其侵染方法和危害方式有着重要的理论和实践意义｡

根癌农杆菌介导的转化体系(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, AtMT),起初用于植物遗传转化｡Bundock等(1995)实现根癌农杆菌介导对酿酒酵母高效转化以来,这项技术已被广泛地运用于丝状真菌的遗传操作,目前已经实现了对泡盛曲霉､粗糙脉胞菌､稻瘟病菌､尖孢镰刀菌和瓜类炭疽等60多种真菌的遗传转化｡根癌农杆菌介导的真菌转化体系与以往的转化方法,如PEG介导的原生质体转化､限制酶介导的插入突变(Restriction enzyme-mediated in-sertional, REMI)等相比较具有明显的优点,主要体现在3个方面｡AtMT转化所用直接受体来源简单,可以是真菌的孢子､菌丝､子实体组织,避免了其他方法中原生质体制备的复杂过程,从而减少了转化的影响因素,提高了稳定性;直接选择具有单核的分生孢子作为受体,得到的转化子不易分化,避免了部分多核真菌利用菌丝体细胞进行转化后转化子不稳定的难题;许多丝状真菌的遗传转化,以真菌分生孢子为直接受体时,可以获得比较高的转化效率｡黄亚丽等提出在实际的转化操作中,采用AtMT程序化的转化体系对不同种属甚至是不同株系的转化结果往往差异很大,造成这样的差异归咎于很多因素,包括真菌本身的生物学特性､真菌直接受体的选取､根癌农杆菌和共培养条件等｡实现不同菌株AtMT的高效转化要求对转化体系进行优化｡这就引出了我们所希望构建的更优转化体系｡李继刚等用Ti双元载体,把质粒pUCATPH 上真菌trpC基因启动子驱动的潮霉素B抗性基因表达盒转移到Ti质粒pPZP111上,构建成用于丝状真菌遗传转化的Ti载体pATZ,为丝状真菌的农杆菌介导遗传转化提供了新的工具｡

Pamela Gan等对感染葫芦和本塞姆氏烟草的炭疽病菌(C. orbiculare)和感染多种作物的C. gloeosporioides (炭疽)的基因组进行测序和分析,在使用定制微阵列感染N.benthamiana (本氏烟草)同时,研究了炭疽基因表达的调节,发现与其他真菌相比,在两个基因组中扩增的基因包括编码小分泌蛋白(SSP),次级代谢物合成基因,蛋白酶和碳水化合物降解酶的序列｡在宿主定植的初始阶段,许多SSP和次级代谢物合成基因被上调,而生长的营养死亡阶段的特征在于编码降解酶的序列的上调,得出炭疽中的半向生体性的特征在于潜在致病基因的扩展类别的不同阶段特异性基因表达的结论｡Pamela Gan等同时指出C. gloeosporioides和C. orbiculare不仅可作为植物 - 病原体相互作用的模型系统,而且还代表两种经济上重要的病原体,其中对病原生物学的更深入理解可直接为靶向疾病控制的策略提供信息｡说明对炭疽菌深入研究的重要性和现实意义｡