文 献 综 述

1.1 燃料乙醇发展基本状况

燃料乙醇，一般是指体积浓度达到99.5%以上的无水乙醇。燃料乙醇是燃烧清洁的高辛烷值燃料。其优点是辛烷值高抗爆性能好，减少矿物燃料对大气的污染，是可再生能源; 缺点是热值低、腐蚀金属。燃料乙醇的生产主要包括发酵和脱水两个过程: 第一步，淀粉糖化后，通过发酵制成乙醇; 第二步，乙醇通过脱水后，制成纯度99.5%以上的无水乙醇^[1]

据国际可再生燃料机构( GRFA) ,2010年全球燃料乙醇产量8580万方( 6770万吨) ,2011年全球燃料乙醇产量约8800万方( 6943万吨) 。美国和巴西仍然是两个最大的乙醇生产国，分别占全球总产量的57%、33%，主要原因为起步早、政策导向明确和原料充足。

图1 美国燃料乙醇产量( 单位: 万方)

图2 巴西燃料乙醇产量( 单位: 万方)

图3 我国燃料乙醇产量( 单位: 万吨)

我国燃料乙醇产业起步较晚，但发展迅速。2001年，我国政府发布《新能源和可再生能源产业发展十五规划》以及《变性生物燃料乙醇汽油十五发展专项规划》，并投资建立了4个大型生物燃料乙醇生产企业，分别为黑龙江华润酒精有限公司、吉林燃料乙醇股份有限公司、安徽丰原生物化工有限公司和河南天冠燃料乙醇有限公司。其中黑龙江、吉林和安徽的3 家企业以玉米作为主要原料，河南省建立的企业主要以陈化粮为原料，年均生产能力均在20万吨以上。2005年我国政府颁布了《可再生能源法》，计划2020年我国生物燃料乙醇的年产量达到1000万吨。2007 年，我国政府又批准在广西建立一个以木薯为原料的燃料乙醇企业，用乙醇汽油替代普通无铅汽油。

推动生物燃料乙醇发展意义深远：

解决能源紧张。随着世界经济的不断扩张，各国对能源需求的压力也越来越大。有数据表明，2000 年，我国一次能源消费量为 7.5 亿吨，石油的对外依存度达到 31%，2002 年，中国进口石油大约 7000 多万吨，预计到 2015 年，石油消费量最少 4 亿吨，对外依存度有可能达到 60%，直接影响我国经济的可持续发展，寻找新能源以保障本国能源安全已成为我国的重要战略目标。估计到 2020 年我国的燃料乙醇获得量可达到 1970 万吨，可占当年中国石油需求量的 7%左右，为中国能源安全提供有力支持，将对节约石油资源，确保国家能源安全具有重要意义^[2]。

减少环境污染。全球每年由于燃烧矿物燃料排放出来的碳达 60 亿吨，同时矿物燃料在开采中也严重破坏了地表生态环境。汽车及内燃机排出的尾气成为大气中二氧化碳的主要来源，汽油中加入一定量的燃料乙醇后，含氧量增加，辛烷值提高，降低了汽车尾气中有害气体的排放，同时，乙醇作为汽油添加剂完全可以替代有害的增氧剂^[3]。

1.2 燃料乙醇开发现状及发展趋势

燃料乙醇一般通过发酵法生产，利用微生物的发酵作用将底物转化为乙醇，按其底物来源，可分为三类：（1）糖类，包括甜菜、甘蔗、甜高粱、瓜干等；（2）淀粉类，包括玉米、小麦、木薯、马铃薯等；（3）纤维素类，包括甘蔗渣、麻类、农作物壳皮、林产品等^[4]。各国根据本国的实际情况选用不同的原料进行发酵，如在美国主要利用玉米生产燃料乙醇，而在巴西则更多的是以甘蔗为原料。目前由于酵母菌所能利用的底物范围十分有限，如不能利用由淀粉水解产生的大部分寡糖，也不能利用纤维素水解中的木糖及有机酸，这些问题还不能得到根本解决，生产燃料乙醇普遍面临着技术不成熟，导致其生产成本偏高，使其发展空间受到很大限制，因此，开发节能生产技术，寻找耐受性更高的菌株是燃料乙醇研究的一个发展方向^[5]。

乙醇发酵过程中，通过糖酵解途径，酵母菌将葡萄糖高效转化为乙醇和二氧化碳，生产的酒精占理论产量的 90%-95%^[6]。然而，此路线存在的重要问题之一是：高浓度乙醇的毒性影响到酿酒酵母的生长、存活、发酵能力, 进而限制了产物浓度的提高^[7]。对酿酒酵母乙醇进行筛选、改造, 提高其乙醇耐受性是解决这一难题的有效方法。

1.3 耐乙醇酵母乙醇发酵的研究背景及意义

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是传统的乙醇生产菌株，工业应用广泛，发酵工业相对成熟，生物安全性高，遗传背景也比较清楚，另外，此种酵母对周围条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐高温酵母的选育提供了可能^[8]。筛选耐高乙醇酵母，在其生产上的优势主要有：①具有较高的发酵能力^[9]；②具有较高的比生长速率，提高发酵效率，缩短发酵周期^[10]；③具有较高的耐酒精能力，菌体对自身代谢产物的稳定性变得更高，因此可以进行超高浓度乙醇发酵；④不易污染杂菌，耐有机酸能力强；⑤能够降低生产水耗、电耗，充分利用现有设备，实现深层酒精发酵^[11]。

研究酵母菌株的乙醇耐受性，有利于选育耐乙醇酵母，增加发酵产物乙醇浓度，促进增产创收， 还可以大大减少下游处理产物蒸馏费用, 有利于节能环保。

1.4 耐乙醇酵母乙醇发酵研究现状

燃料乙醇工业要想取得优良成绩，有赖于优良菌种的利用。从工业发酵的角度来看，菌种选育的最终目标，就是通过人工干预，使筛选出的优良菌种在符合经济要求的条件下尽可能表现出所需要的优良性状。

目前，人们正采用不同的手段，从各个方面来筛选构建具有这种特性的酵母菌。随着对微生物生理、生化研究的深入及基因工程技术的日臻完善，人们通过基因工程和分子生物学手段进行有精确目标的基因操作改变微生物代谢途径已有不少的研究报道。目前最有前景的工作集中在对酵母细胞耐性机理的研究上，利用代谢工程对酵母胞内代谢网络进行精确定量分析的基础上，通过相关循环操作最终达到对菌株的优化和完善。目前，对于乙醇酵母的代谢研究主要涉及碳源、氮源、金属离子和不同渗透压等方面^[12]。研究表明，当酵母在胁迫环境下，如高温、高渗透压、高浓度酒精等，大范围热休克蛋白被诱导表达，其中sym1p是定位于线粒体内膜的整合蛋白，在热休克期间线粒体呈现一定的代谢功能^[13]。SYM1 基因的这些功能特点对于构建耐高乙醇乙醇酵母有着重要意义。但是，如前所述，酵母的发酵性状是受多基因、多途径调控的，这些基因广泛分布在整个基因组中，且每个基因只负责一部分的表型变化，因此在当前的技术条件下，很难确定控制表型的基因，通过代谢工程对酵母进行改造往往达不到预期的效果。长期以来，传统育种方法因操作简单，目前乃至今后相当长的时间内仍将被广泛使用，特别在我国大部分发酵工业中。

1.5 耐乙醇酵母乙醇发酵的影响因素

1.5.1 海藻糖

储存糖类如海藻糖能够阻止过多的盐类进入酵母细胞引起不可逆的脱水。酵母在压力条件下生长时，能够积累海藻糖达到细胞干重的15%^[14-15]。海藻糖有降低膜渗透性和保证蛋白质合适折叠的功能。在乙醇压力下，海藻糖合成相关基因，包括TPS1、TPS2、TSL1、PGM2和UGP1的表达量上调，经常可以观测到海藻糖合成基因和热激蛋白（HSP）基因的共诱导^[16-17]。中间代谢物海藻糖-6-磷酸是酵母细胞中糖酵解的调节者，能够抑制己糖激酶，避免由于葡萄糖的过磷酸化而造成的细胞内Pi和ATP的消耗，维持糖酵解中的ATP消耗-再生的平衡^[18]。有趣的是与海藻糖降解相关的基因，例如NTH1、NTH2和ATH1，也受到乙醇压力的诱导^[19-20]。由于海藻糖的高水平积累可能引起酵母中重要酶的功能失活，如谷胱甘肽还原酶，焦磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶^[21]。因此，海藻糖降解相关基因的共诱导可能是为了调节最适的海藻糖浓度以应对乙醇压力。

1.5.2 细胞质膜成分与酵母耐热性

在酵母的代谢过程中，细胞质膜具有屏障作用，控制营养输送进入细胞和产物分泌于周围基质中，影响依赖于蛋白的促进扩散速率。它由两部分组成：脂质双分子层和结合其上的膜蛋白^[22]。酵母耐热性与质膜上的脂类和蛋白有一定关系。

高浓度乙醇应激能引起膜的无序化，促使蛋白的变性，同时，它还增加了原生质膜的渗透性，会导致质子流的上升。其中与乙醇耐受性相关的膜蛋白研究最多的当为 ATP酶，它是一种重要的膜蛋白，位于细胞膜内侧，其主要功能是催化胞内 ATP 的水解并伴随将胞内 H 泵出胞外的反应，建立跨膜的电化学梯度，用于驱动菌体生长所需营养物质的主动运输，对维持细胞结构稳定具有重要的作用^[23]。在乙醇胁迫下，酵母体内的质膜 H -ATPase 残基的活性被激活，质膜 ATP 酶的活性上升，从胞内排出质子的活性变强^[24]。麦角固醇是酵母细胞膜上最主要的固醇成分，大约占酵母干重的 1%~2%。它以两种形式存在，分别为游离麦角固醇和麦角固醇酯。其中游离麦角固醇主要分布在细胞膜上，它不仅与细胞膜的流动性和完整性有密切联系，还对膜蛋白具有多种作用^[25]。高麦角固醇含量也与高乙醇耐受性有关，与麦角固醇合成相关基因ERG2、ERG3、ERG5、ERG6、ERG24、ERG28的缺陷都导致酵母在乙醇压力下生长变慢^[26-30]。但是，这些基因在乙醇压力下都是下调的^[19-20]。很显然这些麦角固醇合成相关基因对乙醇耐受性是重要的，但可能不是在转录充裕的水平上进行调控的。

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