毕业论文课题相关文献综述

糖苷酶是一类水解各种含糖化合物中的糖苷键生成单糖、寡糖或糖苷类复合物的酶。糖苷类化合物是自然界中一类重要的化合物, 在生物、医药、食品等领域均有着广泛的利用价值。但是目前天然化合物在医药领域的应用还存在一些局限，如水溶性差，生物利用度低等。通过对天然化合物进行结构修饰可以显著改善其水溶差的问题，增加其生物利用度。目前对天然化合物进行结构修饰的主要手段有化学法和生物转化法(Biotransformation) 化学法通过对先导化合物中活泼反应位点的修饰得到一系列的衍生化合物,经过活性测试及构效关系研究,确定结构中的药效团,然后对药效团以外的部位进行优化使活性和生物利用度提高^[1]。生物法是利用生物体系或其产生的酶制剂对外源性化合物进行结构修饰的生物化学过程。生物转化法具有一些化学法无可比拟的优点,如反应条件比较温和;无需保护和脱保护,区域选择性和立体选择性高;能够进行一些化学方法难以进行的反应,不污染环境等。目前生物转化修饰结构已涉及羟基化、环氧化、糖基化、异构化、酯化、水解、重排、醇和酮之间的氧化还原、脱氢反应等多种反应类型,其中对天然化合物进行糖基化修饰一直是进来的研究热点。

1.1糖基化方法

1.化学合成

通常的糖苷化反应都是在糖给体的异头位放上离去基团, 在特定促进剂的活化作用下, 与受体醇羟基发生取代反应形成糖苷键^[2]。常见的糖苷给体有溴苷、氟苷、硫苷、羧酸酯苷、磷酸酯苷等。但是, 由于糖多羟基的结构, 取代反应位置的选择在合成中尤为重要, 一般可通过适当的方法将特定位置的羟基保护, 使之保留生物学活性, 发挥药效。

2.酶促合成法

酶促合成法是利用糖基转移酶作为催化剂合成糖苷化合物的方法, 该方法具有快速、高效、立体专一性和反应条件温和的特点^[3]。随着克隆基因的表达和蛋白质纯化技术的进步, 酶促合成的应用领域将更加广泛。已报道的在黄酮类化合物糖苷合成中所采用的游离酶主要可分为糖基转移酶和糖苷酶。糖基转移酶催化的合成反应通常需要活化的核苷磷酸糖为糖基供体,但核苷磷酸糖价格昂贵,这在很大程度上限制了此途径的实用价值。相对地,糖苷酶来源广泛,比较稳定,能接受不同结构的底物,可直接以非保护或非活化的寡糖为糖基供体,通过逆水解反应实现糖苷合成,但转化率一般较低。提高糖苷酶转化率的方法有：降低转化体系中的水活度以抑制糖苷酶的水解反应使反应向糖苷合成方向进行,加入有机溶剂来增加底物浓度等,因此一般在糖苷化反应中利用水-有机溶剂单相体系,但在该体系中酶易失活。为解决这一问题,近几年超饱和溶液体系和玻璃态体系等新型反应体系已应用于糖苷化反应,同时耐有机溶剂极端微生物及酶类的发现,解决了酶在有机溶剂中稳定性的问题,为非水相体系中黄酮类化合物的糖苷化反应提供了广阔应用前景。β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobiase，CB或β-G）和苦杏仁苷酶^[4]。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶^[5]。后来研究发现，β-葡萄糖苷酶存在于植物、昆虫、酵母、曲霉及细菌体内。微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candidapeltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用^[6]。目前，国内外多家研究机构正致力于β-葡萄糖苷酶的分子生物学研究，以期望更好改善纤维素酶的催化效率，利用纤维素资源。

1.2微生物表达β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶基因方面的研究已经有较长的历史，到目前为止，已经有上百个微生物的β-葡萄糖苷酶基因得到克隆，其中以微生物和植物为主。PranitaRoy等将Pichiaetchellsii的β-葡萄糖苷酶的基因进行克隆、测序并将其在大肠杆菌中表达，分析得到开放阅读框1515bp，预测编码蛋白质量54kDa，将表达后的酶液进行SDS-PAGE，结果证明蛋白质量为52.1kDa。李远华等将与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树β-葡萄糖苷酶cDNA通过pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到EscherichiacoliBL21 (DE3)中表达，诱导产生了63kD的融合蛋白，并主要在细胞质中以可溶性蛋白形式存在^[7]。融合蛋白具有正常的生物学活性，能催化葡萄糖苷键的水解反应。早期的β-葡萄糖苷酶基因的克隆是通过构建DNA文库进行活性筛选的方式获得的。随着基因工程技术的发展，PCR技术的应用，利用种属相似性扩增克隆得到许多β-葡萄糖苷酶。到目前为止，乳酸菌属（lactobacillus）就有11种之多。随着基因工程学的发展，越来越多的微生物基因组全序列被测定^[8]。利用同源序列筛查定位分析出可能的β-葡萄糖苷酶，是获得β-葡萄糖苷酶新基因的有效手段。

全细胞生物催化是指利用完整的生物有机体（即全细胞、组织甚至个体）作为催化剂进行化学转化的过程，这种反应过程又称为生物转化（biotransformation）。生物催化剂中常用的有机体主要是微生物，其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化^[9]。而绝大多数酶的化学本质是蛋白质。酶催化具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。更加适用于现代化生产^[10]。

β-葡萄糖苷酶作为木质纤维素降解酶系的重要组分,对于其它酶组分的合成有一定的调控作用^[11]。 目前,对斜卧青霉基因组的测序工作已经完成,对其纤维素酶合成调控的研究也已取得一定的进展。但是由于其纤维素酶酶系复杂,涉及的调控层次和调控途径众多,传统的针对单基因的研究方法很难揭示木质纤维素酶合成调控的整体网络因而产量很低，不利于工业应用和纯化因而需要将其克隆并实现其在工程宿主菌株（大肠杆菌）内的异源表达，为纯化和工业化应用打下基础^[12]。完善对合成调控网络的认识,找到工程改造的新靶点。