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文献综述

1大肠杆菌重组蛋白表达系统

大肠杆菌表达系统是基因工程中运用最早、效率很高的经典表达系统。上个世纪70年代，发现外源cDNA片段转入大肠杆菌能引起其表型的改变，这表明外源基因能够在大肠杆菌中呈现有功能的活性。紧接着《Science》发表了以乳糖操纵子、质粒为基础建立的大肠杆菌系统一文，拉开大肠杆菌在基因工程和蛋白质表达领域应用的序幕。尽管现如今开发了越来越多的表达系统，但因大肠杆菌体系所独具的优势，其在基因工程和蛋白表达领域仍占有重要地位。目前大肠杆菌体系已用于制备多种酶制剂，甚至一些药用蛋白质，如干扰素、胰岛素和人血清蛋白等生物药，见图1-1，在生物技术领域取得了令人瞩目的成果[1]。

图1-1常用于生物制药和工业酶市场的菌株[2]

Figure1-1Strainstypicallyusedinthebiopharmaceuticalandindustrialenzymemarket.

大肠杆菌因其培养条件简单、生长周期短、生产成本低、遗传背景清楚、生理学特性明确、可供选择利用的载体多、目的基因表达高效及安全性能好而成为目前应用最广的表达体系，但其也存在很多不足之处[3]，如来源于真核生物蛋白在大肠杆菌体系中表达时，大肠杆菌因缺少真核生物修饰酶，故翻译后很难完成对该类蛋白的修饰，使得表达出的重组蛋白无生物活性。用该系统表达来源于原核生物不需要修饰的原核蛋白时，其表达量常常是制约问题。重组蛋白在大肠杆菌中表达水平受到很多因素影响，如表达载体的选择、外源基因的稀有密码子情况、菌体培养条件以及翻译起始效率等。

1.2翻译起始效率

大肠杆菌中蛋白质翻译起始过程见图1-4，蛋白质翻译的起始是核糖体30S亚基和tRNAMetf与mRNA的结合，形成三元复合物。蛋白质翻译起始效率是多个因素一起作用的结果。主要因素有：SD序列、起始密码子及SD序列与起始密码子的间距。随着人们对蛋白质翻译起始过程的研究，发现翻译起始效率对重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达有很重大的影响。

SD序列为4至5个核苷酸，富含嘌呤（AG），在起始密码子的上游。它与核糖体30S亚基的16SrRNA相互作用，帮助识别翻译起始位点[4]。大肠杆菌基因多选用AUG作为起始密码子，只有极少基因选择GUG（14%）和UUG（3%）作为起始密码子[5]，而革兰氏阴性菌多选用UUG作为起始密码子[6]。起始密码子AUG与tRNAMetf的反密码子（UAC）配对结合,开启蛋白翻译的开关。SD和AUG对蛋白翻译起始效率有很大影响，并且两者之间的间距也对翻译起始效率有很大影响，两者最适间距为5-8个核苷酸[7]。