毕业论文课题相关文献综述

蔗糖是高等植物光合作用产物运输的主要形式，为细胞的正常生长发育提供碳源和能源，在植物的生长发育和代谢过程中具有举足轻重的作用。植物中与蔗糖代谢有关的酶有三类，分别是转化酶或G-呋喃果糖苷酶(Inv)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SUS)，其中蔗糖合成酶是催化蔗糖代谢的关键酶之一。蔗糖合成酶具有分解和合成蔗糖的双重属性，在调控蔗糖代谢中可能起很重要的作用，主要催化的反应是：蔗糖 UDP=UDPG 果糖^[1]。但普遍认为蔗糖合成酶的主要功能是分解蔗糖，为多糖以及糖苷类化合物的合成提供前体。蔗糖合成酶是促进生物体内的蔗糖进入各种代谢途径的关键酶，蔗糖是细胞代谢的调控因子，同时蔗糖具有信号导向功能，此外，蔗糖还参与调控植物的发育、分化、果实的成熟等过程，而这一系列的过程都是由蔗糖合成酶参与完成的。近年来，人们在研究蔗糖合成酶的代谢途径及催化机理等方面取得了很多的成果，研究方向包括蔗糖的合成代谢途径、相关酶活性与蔗糖含量的关系以及重要基因的表达调控等方面^[2]。比如，Birgit Sauerzapfe等通过将土豆来源的蔗糖合成酶基因在大肠杆菌和酵母菌中进行表达和对比，详细研究了土豆蔗糖合成酶的催化性质^[3]。刘燕等在地黄蔗糖合成酶的研究中，利用高效液相色谱法建立了较为精确的蔗糖合成酶酶活性的测定方法^[4]。高向阳等则对普通玉米和超甜玉米苗期蔗糖合成酶与磷酸蔗糖合成酶的活力进行了比较^[5]。但是这些对蔗糖合成酶的研究大多集中于常见的产糖类植物，且研究手段多以简单的克隆表达为主。我们认为研究拟南芥等一些模式植物中的蔗糖合成酶，有利于拓宽蔗糖合成酶研究的基因来源。在克隆表达时结合密码子优化等手段也有利于发现催化性质更好的蔗糖合成酶。

蔗糖合成酶（SUS）催化下列可逆反应：蔗糖 UDPUDPG 果糖，其中U代表尿苷^[6]。UDPG名为尿苷二磷酸葡萄糖，是合成糖苷类化合物时葡萄糖基的直接供体。高能态的UDPG可容易的将其糖基供给糖苷类化合物的合成。在许多双糖和多糖的合成中，UDPG也都起着糖基供体的作用^[7]。这个课题中，我们主要任务是全基因合成一个拟南芥蔗糖合成酶的基因并利用定点突变等手段对其基因进行了密码子优化，然后在大肠杆菌中表达。利用蔗糖合成酶我们希望能够高效的催化蔗糖水解生成UDPG^[8]。我们通过PCR的方法克隆出了我们需要的蔗糖合成酶目的基因。再将该目的基因片段通过质粒载体转化到大肠杆菌菌体内进行表达。但是在这样的条件下会有很多不可溶蛋白，形成包涵体，失去了应有的酶活性，不利与研究进行^[9]。所以我们首先优化表达条件，希望可以增加酶可溶性表达。由于酶是在大肠杆菌中表达的，表达完毕后需要对酶进行纯化，因此在后续的研究中还需要建立一个完整的酶相关性质的测定体系，以便于从酶活性及酶稳定性等多方面对该酶的酶学性质进行综合的定性定量分析^[10]。通常采用His-tag方法纯化，再用DNS法（二硝基水杨酸法）和HPLC法（高效液相色谱法）检测^[11]。

DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的^[12]。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中^[13]。本研究课题中是利用DNS能与反应产物果糖发生反应生成红色物质而定量与定性测定反应物的量与酶活性的。高效液相色谱法主要是将甲醇、水和样品的混合物通过碳十八柱，开始检测时在不同的时间就会出现不同的峰，通过计算这些峰的峰面积之比可以得到原料和产物的摩尔比，从而可以对酶活性进行定量测定。高效液相色谱法对于测定食品、果实、植物组织等材中的单糖、低聚糖含量已经有很多报道，其中就包括蔗糖的测定，表明蔗糖的HPLC 测定方法应用已比较广泛^[14]。HPLC 方法可以准确测得酶反应液中蔗糖的含量，排除其他糖和色素对结果的干扰，从而准确计算出反应前后蔗糖含量的变化，得出酶活性^[15]。且前处理简单不需要透析，进样体积小，操作方便。HPLC法测定SS、SPS 活性的RSD 小于5%，表明HPLC 法可做为蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活性的测定方法。从测得的酶活结果来看，两方法测得酶活结果相差较大，目前DNS法用的比较广泛，而HPLC法更为准确^[16]。

本课题研究目的及意义：以含拟南芥来源蔗糖合成酶基因的工程菌BL21-DH5α/Pet28a-SS为实验对象，通过优化培养温度、PH、诱导剂浓度等各种反应条件，增加蔗糖合成酶可溶性表达，并结合DNS法、HPLC等检测方法，对蛋白含量、酶活力及稳定性等指标进行测定，定量描述优化效果^[17]。为后续构建蔗糖合成酶-糖基转移酶辅酶循环体系奠定基础。

参考文献

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[3] Birgit Sauerzapfe, Engels. Broadening the biocatalytic properties of recombinant sucrose synthase 1 from potato (Solanum tuberosum L.) by expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae[J]. ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, 2008，43:289-296.

[4] 刘燕,伊伟贞,焦连魁. 高效液相色谱法测定地黄蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活性[J].中国农学通报2011,27(15).

[5] 高向阳,徐凤彩,赵亚华. 普通玉米和超甜玉米苗期蔗糖合成酶与磷酸蔗糖合成酶的活力比较[J].华南农业大学学报, 2001,22（02）.