文 献 综 述

大肠杆菌的argE基因编码N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶(N-acetylomithine deacetylase，NAOase，EC3．5．1．16)，可选择性的作用于L-型酰基化氨基酸，NAOase具有广泛的底物特异性，可立体拆分消旋化氨基酸生成L-氨基酸，可作为一种新型的手性拆分酶源。NAOase是原核生物精氨酸合成代谢中的关键酶，产物鸟氨酸是多胺类物质合成的前体。多胺与DNA复制及细胞分裂有关，因此NAOase的活性对细菌繁殖必不可少。而真核生物不含NAOase，故可以argE编码的NAOase为作用靶标来研究新型抗生素，本文主要研究NAOase的高效表达与纯化。

1 N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的来源与作用

从微生物中，从谷氨酸到精氨酸的生物合成途径包括8个酶催化反应步骤[1]。第五步反应，不同的菌种采用不同的酶催化N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶（N-acetylornithinedeacetylase，简称NAOase；EC3.5.1.16）。1953年，Henry 等阐明了E. coli. 内鸟氨酸的生成途径，即从谷氨酸开始经乙酰谷氨酸、乙酰谷氨酸半醛到乙酰鸟氨酸，乙酰鸟氨酸再脱酰基生成L-鸟氨酸。此反应途径也是E. coli. 内鸟氨酸合成的唯一途径。不同的菌种采用不同的酶催化N-乙酰鸟氨酸脱去乙酰基，例如在链球菌属及红面包霉菌中是由鸟氨酸乙酰转移酶（Ornithine acetyltransferase，EC 2.3.1.35）将乙酰基转移给谷氨酸，产生鸟氨酸和乙酰谷氨酸。

催化乙酰鸟氨酸脱酰基的酶兼具乙酰酶和肽酶的活性，呈现出转氨酶的活性。早在1956年，Bonner等人在大肠杆菌中发现了N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的存在[2]。催化的反应式为：

他们对酶简单纯化后，初步研究酶的生化性质，提出Co2 和谷光甘肽对酶有促进作用，而Cu2 、Zn2 、Ni2 、EDTA和对氯高汞苯甲酸盐对该酶有抑制作用。此外，他们还研究了该酶的底物特异性，证实该酶不仅可以催化乙酰鸟氨酸，还可催化乙酰丙氨酸、乙酰亮氨酸、乙酰甲硫氨酸等其它酰基化的氨基酸。

随着分子生物学和基因工程的快速发展，迄今为止，已经在细菌、真菌、霉菌等多种微生物中以及动植物中鉴定出了N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶。Thierry Meinnel等于1992年首次从大肠杆菌中分离得到argE基因[3]，经分析该基因全长1400 bp，编码42350u的多肽链。在大肠杆菌基因图谱中显示oxyR为argE基因的表达操纵子。研究发现序列中有三个可能的起始密码子，经突变技术确定第三个ATG是表达argE基因的起始密码子。除这以外，还发现广泛存在的两种等位基因，一种是在AB1157菌株中发现的等位基因argE3，它是一种赭石型突变[4]；另一种等位基因来自于菌株XA100，它是一种琥珀型突变[5]。此研究从遗传学角度揭示基因序列，为进一步研究该酶催化机制及其结构奠定良好基础。

2 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的酶学性质

从的结构式可以看出，它是一种含金属锌的酶，有两个相同的亚基组成。根据氨基酸的序列，每个亚基的分子量为42350D。在进化同源性上，该酶与三种已知的具有氨基酰化酶活力的酶有很高的序列同源性及相似的生化性质[5]。它们是来自E.coli中由dapE编码的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶、假单胞菌中由cpg2编码的羧肽酶G2以及猪肾脏中由aacⅠ编码的氨基酰化酶Ⅰ。这些水解酶均是含有金属Zn的酶，并且它们的亚基分子量很相近，约43Kda左右且都只能水解α-N-酰基-L-氨基酸。

1997年，Rowsell等得到了羧肽酶G2的三维结构[6]。经解析，该酶含有3个二硫键，活性部位有两个Zn（Ⅱ），每一个Zn离子与一个组氨酸残基、一个谷氨酸残基、一个天冬氨酸残基及一分子的水相结合。而这些关键的氨基酸残基同样存在于argE、dapE编码的蛋白质氨基酸序列中。这为研究乙酰鸟氨酸脱酰基酶的结构及功能又提供了有力的依据。