开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)
一.研究背景
成纤维细胞生长因子21(FGF21),是FGF家族中的一员,主要表达在肝脏、胸腺、脂肪组织、胰腺的胰岛beta;细胞中。FGF21前体有209个氨基酸,成熟后由181个氨基酸组成,包含beta;三叶草样结构及无规则N端和C端结构,有疏水性氨基酸末端,等电点约为5.4,相对分子质量约为22kD,半衰期短,对热不稳定,与肝素的结合能力较低,且不具有促有丝分裂的功能。FGF21能诱导脂肪组织、胰腺和肝脏起源细胞的多种信号通路和功能活动,如激活非胰岛素依赖的葡萄糖吸收,促进脂肪生成;抑制葡萄糖介导的胰高血糖素的释放,刺激胰岛素的释放并抑制胰岛细胞的凋亡;抑制肝糖原的输出,对治疗糖尿病,肥胖等代谢性疾病具有重要意义。
随着对FGF21了解的深入,研究发现FGF21不仅与代谢疾病甚至还与癌症相关,因此致力于开发FGF21药物成为近年来的研究热点。近年来,研究者们开发了多种方法如PEG修饰、Fc融合、定点突变等来延长FGF21的半衰期、改善稳定性,但是目前仍然没有相应的长效化FGF21药物上市。因此开发更加安全有效的长效化FGF21分子已经成为糖脂代谢研究的热点之一。基于PEG修饰的优缺点,研究者们开发了模拟PEG的聚多肽融合技术,即利用DNA重组技术将药用蛋白与特异性的氨基酸链融合表达,达到延长药物血浆半衰期的目的。本实验室前期构建了一种新型聚多肽-FGF21融合蛋白,可以延长体内半衰期,增加稳定性,降低免疫原性。药品安全、有效、质量可控一直是新药审批的基本原则,蛋白质纯度检测是重组蛋白质药物质量标准的重要指标之一。本课题针对聚多肽-FGF21融合蛋白建立纯度分析方法,将为新药研究奠定一定的基础。
二.研究内容
本课题根据蛋白纯度分析的常用方法,选择反相高效液相色谱法(RP-HPLC),分子筛排阻色谱法(SEC-HPLC)和非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳法(非还原SDS-PAGE)三种方法进行纯度分析方法的建立,从而对中试规模发酵的原液进行纯度分析,为新药研究奠定基础。
三.研究方案
1. RP-HPLC法的建立及方法学验证
1.1 RP-HPLC法的建立
1)检测波长的考察
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