1、课题背景
自1975年Kohler和Milstein 将骨髓瘤细胞和免疫细胞融合形成具有无限增殖能力的杂交瘤细胞后，杂交瘤技术便广泛运用于单抗的制备，也从此开启了单克隆抗体用于疾病治疗的新时代，鼠源单抗、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体相继涌现。同时，出现了不少明星单抗产品，如美罗华、赫赛汀、恩利、安维汀、修美乐...回顾近几年全球药物销售排行榜前十名，其中单抗产品占到1/3，“药王”修美乐更是连续几年占据榜首。单抗作为一种特药，能够治疗一些普通药物不能治疗的重大疾病、罕见病，同时对人体产生更小的副作用，实在是向精准医疗迈进的一大步。
然而，单抗仅能通过注射给药，若发生不良反应事件，后果可能会非常严重。因此，单抗的制备技术壁垒较高，规模化工艺生产具有较高的技术要求，尤其是纯化质控难度较大。由于细胞传代、培养等各方面可能存在不稳定表达的原因，同时由于蛋白质构象复杂、存在聚集、断裂成亚单位等问题，所以单抗的纯化和层析的关键操作点的控制就显得尤为重要了。
- 基本内容
2.1 课题概述
规模化抗体药物的纯化的主要目的是将目的蛋白与杂质进行分离，最终获得高纯度、低潜在风险的抗体药物，纯化包括生产罐培养后的深层过滤、亲和层析、低pH孵育除病毒、阳离子交换层析、阴离子交换层析、除病毒过滤、超滤浓缩置换等步骤。其中亲和层析是获取目的蛋白的关键一步，研究表明，以Protein A为亲和配体的亲和层析，通过一次层析就可以将95%的目的蛋白捕捉，而大部分的培养基复合物、盐类以及杂质在通过层析柱时流穿除去。由于亲和层析的高选择性和特异性，使其成为抗体纯化非常有效的方法，缩短了纯化工艺时间，可作为单抗纯化的第一大步，为此我们更应该做好亲和层析关键操作点的控制，避免给后续纯化造成更多的麻烦，这也是本次课题的研究重点。
层析过程关键控制点通常包括以下几个方面：层析设备（包括层析柱）、层析物料（包括待层析液和层析填料），层析操作方法和操作环境。
通过层析过程的控制，我们所要达到的目的是：保证我们得到的抗体药物符合一般药品的三原则“安全、有效、质量可控”。具体来说就是，单抗通过纯化后保持应有的构象、纯度和活性，同时应该排除内毒素、热源、病毒、微生物以及其他一切能引起质量问题的因素。
2.2 关键操作点
基于以上概述，对具体的关键操作点进行相关说明：
- 设备
- 系统完整性：柱层析系统应以运行压力进行测试，以证明系统不会泄漏。
- 检测器：紫外检测器、电导率检测器等生成的数据用于工艺控制，应确定可接受的运行范围，线性响应极限，反应时间，检测器及记录器与运行流量的响应，确保检测器的灵敏度。
- 流量/压力：层析系统的流量及压力作为工艺控制的参数，需证明其在正常运行条件下输出要求的流量，确定流量的偏差允许范围。
- 层析柱：层析柱材质应符合层析用标准，柱效和柱压应符合工艺要求。
- 物料
- 待纯化液：蛋白质在高浓度时有发生聚合的倾向，从而导致表观分子量增加，降低扩散速率，影响亲和作用；若蛋白浓度过低，则亲和捕捉效率低，从而延长工艺时间。因此需将待纯化液的蛋白质浓度控制在合理范围内。
- 工艺化学品和耗材：化学品应与药品生产使用的其他原料以相同的方式处理和控制；耗材应符合相关sop要求。
- 缓冲液：各类缓冲液的pH和电导率对层析的效果有着决定性的影响，应符合相关sop的要求。
- 填料：介质颗粒及空隙应大小一致，且具有良好的流动性能，能与亲和配基结合牢固，不易在洗脱时脱落，且运行大分子无障碍地接近亲和配基。
- 亲和配体：Protein A的捕捉能力随使用次数增加而下降，其保存、取用等应符合相关sop的要求。
- 工艺方法
- 缓冲液的配制：符合工艺sop规定。
- 层析柱的拆装和清洁：符合工艺sop 规定。
- 固相载体与配体的耦联：降低对亲和作用的影响。
- 系统处理：降低或消除层析系统残留对层析过程的影响及层析过程对设备的影响。
- 工艺参数：层析的流速、温度、流动相与固定相之比、上样量等对层析工艺的影响。
- 中间点控制：中间产品蛋白含量、SEC、CEX、微生物限度、细菌内毒素对产品质量的影响。
- 环境
- 空调系统：洁净区温度、湿度、压差、微生物、粒子等对产品工艺和洁净区环境的影响。
- 水系统：工艺用水的质量对产品质量的影响。
- 气体系统：压缩空气的压力、质量对层析系统的影响。
- 人员卫生：对洁净区环境、产品的影响。
2.3 预期的结果
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