干扰素突变体融合抗体体外活性研究文献综述

 2022-12-19 19:39:32

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

  1. 课题研究的意义

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)又名大肠癌，是消化系统常见的恶性肿瘤,，世界范围内每年约有1200000例新发病例，是世界上第四大癌症死亡原因。[1]近年来我国CRC的发病率在人民生活水平的提高以及环境因素的影响下也呈现上升趋势。目前，治疗CRC依然主要依靠手术、化疗和放疗。大约75%的CRC患者在早期阶段(StageⅠ-Ⅲ)可以被确诊，接受过根治手术切除，但总体的5年生存率仍只有 50%～60%，约 2/3的手术患者会发生复发或远处转移。[2]而在中晚期阶段被确诊的患者，只能接受化疗或放疗，放疗由于放射线的特殊性，可能在治疗过程中带来新癌变的发生，且由于副作用大，其疗效受到了很大限制, 化疗能作用于全身更多部位，但由于选择性差，毒副作用非常明显，还有可能产生耐药性，除此之外一些禁忌症也给治疗带来极大困难。近年来兴起的抗肿瘤抗体药物及干扰素药物成为新的治疗策略。

抗肿瘤抗体药物利用生物分子的特异性结合特点来降低传统化疗的无选择性和不良反应，如针对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)应用的抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体。大量的临床病理研究表明，VEGF在40%-60%的CRC患者中存在过表达，人VEGFR2称为KDR（kinase inserted domain containing receptor），是VEGF的主要受体之一，它与VEGF-A结合引起细胞增殖、迁移、存活和通透性的改变。抗VEGFR2抗体阻断VEGF受体与其配体VEGF的相互作用，可以有效的抑制肿瘤新生血管的形成，达到抑制肿瘤生长的目的。但由于肿瘤基因的改变而导致的对抗体药物抗药性成为其应用的障碍。干扰素(Interferon,IFN) 是一种具有广泛生物活性的细胞因子，具有抗病毒、免疫调节抗细胞增殖以及诱导细胞分化等功能。在临床上的应用IFN治疗恶性肿瘤表现出了抑制细胞增殖分化、抑制致癌基因的表达及激活T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等作用。[4]Ⅰ型干扰素IFNalpha;是高度转移性实体瘤治疗的经典药物。尽管IFNalpha;可以对肿瘤有直接细胞毒性活性,抑制血管生成,并刺激先天和适应性免疫, 但因半衰期短、系统性毒副作用强等缺点限制了其在临床上的应用。研究者们将IFN与PEG、白蛋白、抗体的Fc段偶联，研发出的各种长效IFN虽然改善IFN在体内的动力学，但这仍然不能避免IFN全身使用时产生的严重副反应。同时，干扰素分子与其受体的亲和力不高，这大大限制了干扰素发挥生物学活性。有文章报道，通过对干扰素分子进行突变，可以明显提高其与受体的亲和力。其中，YNS突变是报道较多的突变方式。突变后的干扰素与受体IFNAR1的亲和力提高了60倍，抗增殖能力提高了3.5倍。[8]这为我们的改造提供了思路。

研究表明，IFN靶向治疗，即抗体-IFN偶联物(mAb-IFNalpha;) 借助抗体靶向性将干扰素分子带到病灶发挥作用可以改善药物动力学，增加局部的浓度，延长半衰期和限制IFNalpha;系统性风险， 即延长 IFN 半衰期及增强药效的同时，并不产生毒副作用从而增加其直接和间接影响和提高治疗指数。[5] 本课题将要研究的融合抗体即融合了靶向VEGFR2的单克隆抗体JZA00与IFNalpha;突变体。该融合抗体经表达纯化后，对其活性进行初步探究。

参考文献

  1. Shu-Zhen Chen.Targeted therapies for colorectal cancer:Current status and future perspectives[J]. World Chinese Journal of Digestology,2017, 25(4): 307-315.
  2. MIAO Qing-fang, SHAO Rong-guang, ZHEN Yong-su *.An overview of antibody-based cancer therapy[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2012, 47 (10): 1261minus;1268
  3. LI Dao-juan,ZHANG Juan *,JIA Xue-lian,FANG Jing-ru,WANG Min *.Study on the anti-melanoma activities of fully human antibody against VEGFR-2 in vitro and in vivo[J].Pharmaceutical Biotechnology,2014,21(4):311-316
  4. LI Chen-chen，REN Xue-yan，WANG Min，ZHANG Juan.Progress in research amp; development of interferon-antibody conjugates[J].Chinese Journal of Biochemical and Pharmaceutics, 2016, 36 (6): 19minus;24
  5. Edmund A. Rossi, Diane L. Rossi, Rhona Stein, David M. Goldenberg, and Chien-Hsing Chang.A bispecific antibody-IFNalpha;2b immunocytokine targeting CD20 and HLA-DR Is highly toxic to human lymphoma and multiple myeloma cells[J]. Blood，2011，118(7): 1877-1884．
  6. 曾洁萍，余勤，梁茂植，段俊国.干扰素抗肿瘤作用研究进展[J].Modern Preventive Medicine, 2008 , 35(18):3650-3652
  7. CHEN Yi-lin,ZHANG Mei-fen,QIN Hui-ying,ZHANG Li-feng,WU Xiao-dan,WANG Xia. Correlation between oral chemotherapy adherence and illness perception in colorectal cancer patients[J]. Chinese Journal of Nursing 2017,52(1):8-13
  8. E Kalie, DA Jaitin,R Abramovich,G Schreiber.An interferon alpha2 mutant optimized by phage display for IFNAR1 binding confers specifically enhandced antitumor activities[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(15):11602-11611
  9. 课题研究目的及内容

本实验将得到的融合抗体进行SDS-PAGE检验JZA02分子量（190kD），Western blotting检测融合抗体JZA02的表达，BCA法测量JZA02蛋白浓度后，通过MTT法评价JZA02对肿瘤细胞增殖能力的影响，流式细胞术评价与与母体单抗有结合的表达VEGFR2受体的肿瘤细胞（SW620，HCT-116）的结合能力及JZA02促凋亡能力，对JZA02的体外活性进行初步研究，并与JZA01进行比较，为进一步的实验奠定基础。

  1. 课题研究的过程及方法

（一）主要过程及流程图

  1. 培养利用实验室已获得的产JZA01的CHO细胞系
  2. 收集细胞上清（内含JZA01）
  3. 纯化融合抗体
  4. 融合抗体体外活性初步研究

（二）检测方法

  1. SDS-PAGE：配制胶（分离胶10%，浓缩胶）、样品及电极缓冲液，组装电泳槽，上样品及Maker，电泳，剥胶，染色脱色，拍照。
  2. Western blotting：进行SDS-PAGE、湿法转膜，孵一抗（4℃,过夜）、标记二抗（37℃，2h）后，进行发光显色，曝光。
  3. BCA法：

绘制标准曲线：取96孔酶标板，按下表加入试剂。

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