开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述）
一．项目简介
小RNA是用于基因沉默的重要技术手段，是作为基因治疗的潜在有效药物。然而，小RNA在转化为临床实际应用的过程却十分曲折。首先，由于RNA分子不稳定，在体内极易被RNA酶降解，因此，寻找到合适的RNA转运载体就显得极为重要。此外，作为一种药物，是否能够将其精准运输到靶组织也是十分重要的。传统的转运方法，因为缺乏组织特异性，易引起过敏反应、毒性反应等，因此在临床应用中受到限制【1】。鉴于这些限制，外泌囊泡，又称外泌体(exosome)，作为机体自身的RNA转运工具，可以解决传统转运方法伴随的诸多问题。外泌体是内源性细胞分泌出的纳米级别的囊泡，可以在细胞间运输小RNA分子,因此其可作为小RNA治疗的潜在载体【2-4】。如果我们在细胞水平进行基因改造，可以使得经修饰后的细胞所分泌出来的外泌体具有靶向性，从而实现高效安全的运输小RNA的目的，弥补了传统小RNA 运输系统的缺陷，开启小RNA治疗的新途径【3】。
将外泌体的运输功能与小RNA沉默技术结合在一起，将成为基因治疗的新方法。有研究发现，内源性产生的外泌体，合并有病毒因子时，能够加强其转运的干扰RNA的靶向特异性【6】。Alvarez-Erviti首次应用这种外泌体来运输外源性的siRNA【5】。实验中涉及到两种主要蛋白，即淋巴相关膜蛋白2b(lysosomal associated membrane protein-2 ，Lamp2b) 是在外泌体表面普遍表达的一种蛋白，狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein ，RVG）是源于狂犬病毒糖蛋白的一种短肽，能够特异性结合到血脑屏障和神经细胞上表达的乙酰胆碱受体。树突状细胞经处理后，可将RVG 修饰到Lamp2b上，从而使分泌的外泌体上可以表达Lamp2b与RVG的融合蛋白。通过外泌体表面蛋白RVG结合血脑屏障和神经细胞上的乙酰胆碱受体，从而使外泌体能够特异性的识别和靶向作用于神经细胞。
为了给exosome特异性靶向组织的能力，我们可以给exosome加上特殊的靶向标记，它可以更好的识别某些特殊的组织或者细胞。整合素受体（Intrigent）在黑素瘤、神经胶质瘤等多种肿瘤细胞表面高度表达，整合素alpha;vbeta;3常被用作肿瘤靶向的特异性靶点。iRGD是一条序列为CRGDRGPDC的多肽片段，它既能有效识别整合素受体又能高效穿过细胞膜。我们将这段RVG肽段作为我们的靶向肽段和Lamp2b蛋白融合，构成了靶向肿瘤细胞表面整连蛋白的iRGD-Lamp2b靶向蛋白。将iRGD-Lamp2b融合蛋白的表达质粒转到肿瘤细胞中，肿瘤细胞分泌的exosome表面就会顺利的带上iRGD-Lamp 2b融合蛋白。这样的exosome就会靶向的与整联蛋白高表达的肿瘤细胞结合，从而顺利将包裹的物质释放入肿瘤细胞中。本课题主要通过在sxosome表面的lamp-2b蛋白的SP区域（信号肽区域）和跨膜结构域（transmembrane domain，TM）之间插入靶向短肽iRGD来获得被iRGD修饰的exosome。并通过探究改造后的exosome 对肿瘤细胞的靶向性，为后续用iRGD修饰的exosome包裹MicroRNA靶向肿瘤细胞来达到治疗目的的研究奠定基础。
二．实验步骤
(一).iRGD-Lamp2b表达质粒的设计
iRGD-Lamp 2b融合蛋白表达质粒载体图谱
- iRGD-Lamp2b表达质粒转染肿瘤细胞
实验试剂：
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