开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景
自从1986年，单克隆抗体进入市场以来，截止2013年，经美国FDA批准上市的单抗药物一共有46种，进入临床试验阶段的单抗则接近220多种[1]。单克隆抗体药物以其靶向治疗的特异性，有效性及其较高的市场回报率，已经逐步发展成为国内外药品市场上一大类新型诊断和治疗剂。 经过鼠源抗体、人鼠嵌合抗体和人源化抗体等几个发展阶段，全人源抗体的开发已成为目前抗体工程领域的研究热点。
单B细胞抗体技术是近年来发展起来的一种高效获取全人源抗体基因的方法。该技术能够对单个的抗原特异性B细胞进行抗体基因的体外克隆和表达，保证了轻重链可变区的天然配对，与传统的全人源抗体制备技术相比，具有效率高、全人源、基因多样性更丰富等优势[2]。利用该技术，Jin等[3]通过酶联免疫斑点微阵列芯片分选法，只用了一周时间就同时从一批人外周血中分别筛选出63个流感特异性抗体分泌B细胞和104个乙肝特异性抗体分泌B细胞，从中成功制备了19株流感和45株乙肝中和性单克隆抗体。Liao等[4]从单个B细胞中扩增流感抗体基因，将其连接至线性表达框并直接转化到哺乳动物细胞中表达，仅用6天时间就从分选的24个细胞中扩增出9对完整的抗体基因并表达，并成功筛选到5个高亲和力人流感单克隆抗体。可见，单B细胞抗体技术在获取全人源单抗方面具有独特的优势。
尽管单B细胞抗体技术具有快速、高效、高通量等优势，但单B细胞技术的应用却受到了极大的限制。
首先，单B细胞技术需要大量抗原特异性人B细胞，目前，人B细胞来源主要依赖于感染病人和疫苗接种者，还有通过免疫含有完整人抗体库的转基因小鼠，但是以上方法操作时间冗长，采血时间难以控制，实施成本昂贵，免疫需要大量的抗原，用于免疫的抗原种类单一，一部分毒性抗原根本无法用于免疫[5]，这就大大限制了抗原特异性人B细胞的来源。为了克服以上问题，一种理想的方法就是用抗原体外直接刺激人淋巴细胞诱导自然免疫反应，从而形成抗原特异性抗体，这种体外免疫法最早出现于20世纪80年代和90年代[6-8]。这种免疫方法是基于分离的PMBC，用L-亮氨酰-L-亮氨甲酯（LLME）处理PBMC以除去NK细胞和细胞毒性T细胞，因为这两种细胞会抑制抗原特异性 B细胞激活，经由体外抗原免疫获得抗原特异性B细胞[6-8]。最近几年，有研究者通过联合使用IL-2， IL-4 和 IL-10等细胞因子选择性体外诱导Th2型T细胞，使得体外刺激后抗体分泌浆细胞的分化显著增加[9-11]。但是目前为止，体外免疫法还不能成为一种获取目标人源B细胞的普遍方法[12]。因此，建立一种高效体外免疫法，迅速大量获取抗原特异性人B细胞，是打破单B细胞技术限制所要解决的第一个科学问题。
其次，目前用单B细胞抗体技术所获得的抗体都是针对乙肝、流感、 HIV 等病毒感染性疾病的[13-15]。而在非感染性疾病的治疗方面，单B细胞技术的应用受到了极大的限制。这主要是由于治疗非感染性疾病的抗体针对的抗原大多是自体蛋白，这些蛋白在人体中存在着自身免疫耐受，获取针对自身蛋白抗原的特异性B细胞十分困难。将单B细胞抗体技术应用于非感染性疾病的治疗性抗体开发，需要解决的关键问题是如何突破自身免疫耐受，获得针对自身抗原的特异性B细胞。免疫原性氨基酸是一类能提高蛋白质免疫原性的非天然氨基酸，如硝基酪氨酸，硝基苯丙氨酸等[16-18]。将免疫原性氨基酸引入蛋白质分子中是突破自身免疫耐受的一种新技术，借助近年来在分子生物学领域中迅速发展起来的“遗传密码扩充技术”， Christoph Kessel等人成功的将对硝基苯丙氨酸（pNO2Phe）定点引入到来源于小鼠的C5a蛋白中，激活了小鼠的体液免疫应答，引起了高滴度IgG抗体的产生，打破了自身免疫耐受[19]。Varun Gauba等人同样运用遗传密码扩充技术将pNO2Phe，3NO2Tyr或SO3Tyr定点引入到TNF-alpha;和EGF蛋白中，证明了免疫原性氨基酸是通过激活CD4 T淋巴细胞从而激活小鼠的体液免疫应答，且其是否能打破免疫耐受与突变的位点和小鼠的MHCII类分子相关[17]。Lani L. Hardy等将抗原表位肽中的酪氨酸置换成硝基酪氨酸，证实了仅在一个位点引入免疫原性氨基酸即可明显影响MHC I类限制性抗原表位的识别[20]。以上研究表明，天然蛋白质中插入此类特殊氨基酸能使其突破自身免疫耐受，转化为自身抗原而激活机体免疫系统。因此，如何利用免疫原性氨基酸引入，突破自身免疫耐受，从而将单 B 细胞抗体技术应用于自体蛋白抗体研究，是打破单B细胞技术限制所要解决的另一个科学问题。
本课题拟在前期研究工作的基础上，首先，采用遗传密码扩充技术，将免疫原性氨基酸——对硝基苯丙氨酸定点引入自体蛋白，如人肿瘤坏死因子-alpha;(tumor necrosis factor-alpha;，TNF-alpha;)，人B淋巴细胞活化因子（B lymphocyte activating factor of the tumor necrosis factor family，BAFF）等，制备一系列含有免疫原性氨基酸的自体蛋白抗原。其次，通过淋巴细胞分步体外共培养方法，加入各种淋巴细胞生长分化必须的细胞因子，用一系列可控的细胞培养过程，模拟人体在免疫应答中各种淋巴细胞之间的协作关系，采用含免疫原性氨基酸自体抗原，建立一种高效快捷的体外免疫法。在此基础上，最终，通过分选型流式细胞仪，分选出抗原特异性的人单B细胞并对其分泌抗体的特异性及种类进行鉴定，为后期开发针对自体蛋白的全人源抗体药物奠定基础。
参考文献
[1] Fekete S, Gassner A L, Rudaz S, et al. Analytical strategies for the characterization of therapeutic monoclonal antibodies[J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2013, 42: 74-83.
[2] Tiller T. Single B cell antibody technologies. N Biotechnol. 2011;28(5):453-7.
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