培养法和PCR法检测细胞悬液中的支原体
1.支原体概述
支原体是自然界中众多微生物的一种，它的个体微小，仅0.1-0.3mu;m，能通过一般的细菌滤器，且没有细胞壁，属于原核生物。支原体分属于革兰氏阴性菌，菌落在固体培养基通常呈“煎蛋状”分布，个体不易被染色，但可用Giemsa染剂染成淡紫色从而被观察到。此外，支原体还可以被荧光附着染色，中国药典2020版中就利用荧光染色的方法的对支原体进行检测。支原体在自然界中分布极其广泛，人类及家畜的体内，水中的鱼类，甚至土壤之中都可以发现支原体的存在。由于支原体分布广泛且可以被人体内常携带，对实验室的生物制品存在极大的威胁，支原体污染一份样品后可迅速扩增污染其他的样品。支原体对青霉素类抗生素不敏感，对红霉素，链霉素，卡那霉素等抗生素敏感，支原体还因其寄生机制来依靠宿主细胞产生逃避免疫清除的机制，并且可以通过这种机制对使用的抗生素产生耐药性。因此在实验室发现支原体后不易被清除，且清除后被污染的生物制品通常无法挽回，只有少部分生物制品在实验中被发现清楚支原体后仍可使用。因此，支原体对细胞的储存，培养及研究；疫苗的制备，都存在很大的威胁，生物制品中支原体是否存在必须要经过严格的检查。目前发现的支原体中大部分是无害的支原体，但仍有部分会对人，畜，日常的生活以及生产上造成危害，比如肺炎支原体（MP）会导致人体非典型肺炎，尤其是对婴幼儿危害大；溶脲脲原体引起人类泌尿系统的疾病，给患者造成心理和生理上的痛苦；猪肺炎支原体（MAP）会造成家猪患上气喘病，威胁家畜和人体的健康。除此之外，还有鸡毒支原体，口腔支原体，莱氏无胆甾原体，精氨酸支原体等上百种支原体已经被发现。
2.支原体检测方法
针对支原体的生物制品检查方法，目前已经多有研究。中国药典2020版中通则3301记载了两种方法检测生物制品中的支原体，分别是培养法和DNA荧光染色法，两种方法的检测限分别达到了1-10CFU 和100CFU，且灵敏度较高，属于适用范围较广，大多数企业商家或者实验室会参考使用的方法。随着分子生物学技术水平的发展，检查支原体的方法新增了灵敏度更高，更加高效的方法，如PCR检测法（灵敏度达到了10-5），环介导等温扩增法（LAMP），实时荧光等温扩增法（SAT），ELISA法等方法。在支原体核酸扩增检测方法（Nucleic Acid Amplification Techniques，NAT）中，PCR法在国内外应用以及研究较多，为了更进一步得到更高的灵敏度，更好的特异性，PCR也衍生出多种方法：多重PCR法，巢式PCR法，实时荧光定量PCR，芯片检测PCR法等。与传统培养法检查支原体相比，分子生物学方法检查支原体有更高灵敏度，更短时间，操作简单的优势，培养法需要至少半个月左右的时间，而分子生物学方法只需要几个小时甚至半个小时，这种高效而快速的检测方法可以满足多种临床检测以及制剂研发过程中对时效性的要求。然而通常分子生物学方法会涉及到引物的设计及相应的试剂损耗，或者对使用的仪器有特殊的要求，成本更大，难以在基层广泛推广。但随着技术的提高，相应的成本也在降低，未来分子生物学方法得到普及使用的可能性很大。
目前针对支原体检测的分子生物学技术中，常通过对16s-rRNA进行扩增检测，有文献指出，对16s-23RNA扩增检测特异性较16s-rRNA要高。此外还可根据支原体编码P36（乳酸脱氢酶L-lactate dehydrogenase,LDH）的基因，编码P46（表面膜蛋白）的基因，编码P97（纤毛结合素蛋白）的基因，编码P110的基因等通过分子生物学的方法进行分析检测。
培养法的优势在于其应用历史久，经过各种研究成果的积累已经取得了灵敏度比较高的培养基配方，操作也较为简便，对于仪器的要求比较低，一直是各大药典中推荐使用的检测方法。中国药典2020版本中列出的PPLO肉汤培养基以及精氨酸支原体培养基能满足检测出大部分支原体的要求。精氨酸支原体在生长发育过程中会分解出氨使碱性增强，培养基内加入的酚红能再培养基PH逐渐上升过程中变红从而达到指示有支原体生长的目的。根据药典指示的要求，培养法检测支原体需要在36℃培养箱培养共42天，检测周期较长。在设置阳性对照组时需要用到活支原体，操作不当可能造成实验室污染。
3.设计方案
本次毕业实验中，预计将使用培养法和PCR法对培养的干细胞产品进行支原体检查。PCR法使用的是来自“杭州华安生物技术有限公司”提供的PCR试剂盒。预计使用沸水浴法使细胞破裂后，12000rpm离心5min并取上清液进行检测，针对支原体的16s-rRNA进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳后预计在250-320bp出现明显条带。本实验中若条件允许，可自行设计引物与试剂盒提供的引物进行扩增后的效果对比。若所得DNA混合上清液中存在对Taq DNA聚合酶活性抑制的物质，还需要考虑设计方法将其除去。培养法预计使用普通PPLO肉汤培养基及药典中提到的精氨酸支原体肉汤培养基并设置阴性对照组和阳性对照组进行对比观察。在使用新的培养基作为检测用培养基时还需要注意对培养基的灵敏度做一个检查试验，查看其是否超过药典中所规定的最低检测限度。培养法的时间周期比较长，且存在传代等操作，应在操作时注意无菌操作，防止污染导致实验失败。
参考文献
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