(一)开题背景与目的
当下很多制药企业从动物肝脏中提取药物的有效成分,这就涉及到,动物肝脏中的提取物的质量是否能得到保障,动物的肝脏提取物是否存在种属来源不确定的问题等等。鉴于存在这样一系列的问题,当下很多药检所都在积极对制药环节中的动物来源的实验原料进行多方面检测与鉴别,并且对鉴别的方法在进行不断的优化,力求能够利用更加准确,更加简便的试验方法对动物来源的实验原料进行种属来源的鉴别。
采用常规的PCR方法快速地鉴别肝提取物的种属来源。利用柱式动物基因组DNA抽提试剂盒从肝提取液或肝浸膏中提取出样品DNA,以其为模板,对样品DNA的特异性片段进行PCR扩增,经荧光染料染色进行琼脂糖凝胶电泳,通过观察电泳结果鉴别样品的种属来源。同时,通过方法学验证对实验结果进行多方面地验证,例如专属性,重复性等。
(二)开题的内容与方法
通过提取肝提取物中的遗传物质脱氧核糖核酸(DNA),对DNA中具有种属特异性的片段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,并对扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测,通过对电泳结果的分析以确定动物源性成分的种属来源,同时,通过方法学验证对实验结果进行多方面地验证,例如专属性,重复性等。最后对扩增产物进行测序确证,以避免非特异性扩增对结果判断产生干扰。
肝提取物中的DNA模板的提取纯化的基本原则是将DNA从细胞基质中释放出来,并去除抑制PCR反应的物质,纯化并富集DNA,以进行后续的PCR反应,在提取过程中,保持DNA结构的完整性是非常重要的,因为从猪肝提取液中提取足够数量和质量的DNA是进行动物源分子学鉴别的基础和关键,鉴于这些因素,故采用柱式动物基因组DNA抽提试剂盒来提取DNA。
在对提取出的DNA样品进行PCR扩增时,因为常规PCR法具有高灵敏度,故会导致因非特异性扩增而产生假阳性结果,所以在进行琼脂糖凝胶电泳之后,需要对其中的核酸进行测序,以验证该PCR属于特异性扩增的正确结果,并非假阳性结果。若从PCR扩增后的DNA溶液中检出与目标序列长度一致的片段,则猪肝提取液中含有猪源性成分。
最后,分别用牛,绵羊,山羊的引物对样品(提取的猪DNA溶液),空白对照(水),阳性对照(牛,山羊,绵羊),阴性对照(除阳性对照外的其余三个基因组DNA标准品)做pcr,然后做电泳,如果PCR产物在相应长度的位置处出现条带,检测结果为阳性,反之为阴性。
(三)实验步骤
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