研究背景
(Ｒ)-3-氨基丁醇(是合成新药度鲁特韦(Dolutegravir)的重要原料。Dolutegravir是由葛兰素史克公司研究开发的抗艾滋病整合酶抑制剂。在2011～2012年期间，该公司研究人员进过了一系列的临床研究，发现在患者接受该药物治疗两年的周期中，其病情得到明显改善;而且与吉列德科学公司(Gilead Science)开发的HIV整合酶抑制剂雷特格韦、埃替格韦相比，其安全性更高。与默沙东的抗HIV/AIDS药物拉替拉韦相比，Dolutegravir不但在三期临床试验中达到了与其相匹敌的疗效，而且不需要与药物促进剂联合用药，同时具有非常强效的耐药属性，并且用药量为日服一次，受药人群广泛。所以在2013年2月，美国食品药品管理局(FDA)宣布将加速Dolutegravir的评审工作，并且于2013年8月13日批准上市。分析师预计，2020年Dolutegravir将成为年销售额达到16.2亿美元的重磅药物。由于Dolutegravir药物非常之新，国内鲜有相关开发工艺的报道。根据原研厂家和其他开发商对Dolutegravir合成路线的总结报道发现，(Ｒ)-3-氨基丁醇是引入构建合成度鲁特韦中手性官能团的关键中间体，其品质的好坏以及价格的高低对于Dolutegravir的品质及生产成本有着很重要的影响。除此之外，它还是抗肿瘤药4-甲基环磷酰胺的中间体，也可衍生为beta;-内酰胺，作为合成青霉烯类抗生素的重要中间体。因此，对(Ｒ)-3-氨基丁醇合成的研究具有重要的意义。目前(Ｒ)-3-氨基丁醇主要是由国外厂家通过化学合成法生产，收率为60%～70%，它在国内的市场属于空白，随着Dolutegravir在国际市场的影响力日益增加，(Ｒ)-3-氨基丁醇市场需求量也将不断增加。近年来国外生产(Ｒ)-3-氨基丁醇的工艺主要是通过化学拆分法、手性原料合成、化学诱导法、制备色谱法和生物酶法等合成方法。
研究思路一种R-3-氨基丁醇的生物制备方法，按照人工设计如SEQIDN0：1所示的序列进行全基因合成，克隆入pET24a得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌获得可以重组D-转氨酶基因工程菌；对该菌进行培养制备重组D-转氨酶；反应溶液中加入终浓度为10-300mmol/L的3-羰基丁醇、质量百分浓度为2-15%的二甲基亚砜或乙腈、终浓度为0.1-lmmol/L的磷酸吡哆醛，终浓度为0.02-lmol/L的异丙胺或D-丙氨酸和质量百
分浓度为0.01-1%的重组D-转氨酶组成反应体系进行反应；反应结束后提取反应液中的R-3-氨基丁醇；本发明成本低，转化率达到97%以上和产物＜得率大于87%，没有副产物，更适合工业应用本实验初步思路步骤为转氨酶的选择—产品手性方法的确立—转氨酶催化体系的确立和优化—产品后提取方法的确立和优化以及产品手型的确认。目前通过查阅资料，得知的大概实验方法有：1.按照人工设计的序列进行全基因合成，克隆入pET24 a得到重组表达的载体，再将重组表达载体转入大肠杆菌获得可以重组D-转氨酶基因工程菌，培养制备重组D转氨酶反应溶液中加入终浓度为10-300mm.1/L的3-羰基丁醇、质量百分浓度为2-15%的二甲基亚砜或乙腈、终浓度为0.卜1 mm.1/L的磷酸Hbl哆醛，终浓度为0.oz Im口J/L的异丙胺或D丙氨酸和质量百浓度为0.01-1%的重组D-转氨酶组成反应体系进行反应;反应结束后提取反应液中的R-3-氨基丁醇;本发明成本低，转化率达到97%以卜和产物得率大于87%,没有副产物，更适合工业应用。
研究内容
步骤一、重组D-转氨酶对该菌进行培养制备重组D-转氨酶。2.通过一种具有高选择性的转氨酶，以4-羟基-2-丁酮为原料，一步合成(Ｒ)-3-氨基丁醇。一种R-3-氨基丁醇的生物制备方法，按照人工设计如SEQIDN0:1所示的序列进行全基因合成，克隆入pET24a得到重组表达载体;将重组表达载体转入大肠杆菌获得可以重组D转氨酶基因工程菌;对该菌进行基因工程菌的制备
选择来源于5/?.的D-转氨酶野生序列，进行人工设计，设计后的基因序列如SEQ ID NO:1所示；将该序列通过全基因合成，克隆入pET24a的Nde I和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体;将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D-转氨酶的重组D-转氨酶基因工程菌；
步骤二、重组D-转氨酶的制备
将重组D-转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37°C培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%;然后置于37°C下培养至0D600值为0.4,加入异丙基-D-半乳糖苷（IPTG）或乳糖，置于28°C继续培养16h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D-转氨酶，采用Bradford法检测其中的蛋白含量，备用；
所述超声破碎的具体方法为：将悬浮液置于冰浴中采用超声波破碎，参数为：工作5s，间歇15s，循环数30。[0014]步骤三、R-3-氨基丁醇的制备
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