Stripak复合物各亚基的表达与纯化文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题，采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

文献综述

Hippo信号通路是在上个世纪90年代果蝇同源嵌合体遗传筛选中最早发现的[1]，该信号通路在器官发育，干细胞功能以及肿瘤发生中扮演重要的角色。通过研究发现，Warts(Wts).Salvador(Sav),Mats和Hippo(Hpo)这四个蛋白组成果蝇Hippo信号通路的中心部分[2]，Warts(Wts).Salvador(Sav)和Hippo(Hpo)属于果蝇肿瘤抑制基因的增生性基因群体，这些基因的突变可以在不改变细胞命运或细胞极性的情况下导致组织的过度生长。生化研究表明，Hpo和Sav直接相互作用进而磷酸化激活Wts/Mats复合物[3-5]。Hpo的激酶活性可以被PP2A和dSTRIPAK组成的磷酸化复合物所抑制[6]。Wts/Mats作为一个蛋白激酶复合体，必须与底物相互作用结合才能起作用。有研究证明，Yorkie（Yki)是果蝇Wts/Mats复合体的主要底物[7]，Yki的失活导致组织萎缩，而Yki的过表达能够引起组织的广泛增生，Wts可以直接磷酸化抑制Yki[8]。

Hippo信号通路进化高度保守，哺乳动物Hippo信号通路元件在果蝇中均能找到同源类似物，哺乳动物的Lats1/2,Sav1.Mob1,Mst1/2分别是果蝇Wts, Sav,Mats,Hpo的同源类似物；YAP/TAZ是Yki的同源类似物[9-11]。类似于果蝇Hippo信号通路，哺乳动物Hippo信号通路的中心组成部分也是一个蛋白激酶链，一经接收到上游信号，Sav1通过SARAH结构域与Mst1/2相互作用进而磷酸化Lats1/2和Mob1,然后火花的Lats1/2/Mob1复合体磷酸化YAP第127位的丝氨酸或TAZ的第89位丝氨酸，进而促进YAP/TAZ滞留在细胞质中被降解失活[12-17]。与此相反，哺乳动物Hippo信号通路失活，去磷酸化的YAP/TAZ进入到细胞核内并积累，与转录因子相互结合成转录因子复合物诱导目的基因的表达[18-20]。尽管研究表明Sav1可以激活Mat1/2，但是具体机制还并未清除，推测是通过调控Mst1的核转位实现的。Mst1/2是促进凋亡的激酶，在凋亡应激下被细胞凋亡蛋白酶激活从而促进细胞凋亡。

Striatin-interacting phosphatase and kinase(STRIPAK)可以将Hippo（Mst1/2)蛋白的活性结构域去磷酸化，以抑制其活性，属于protein phosphatase 2A(PP2A)的一种。

STRIPAK包括激酶和磷酸酶，是一个以striatin为中心的多组分超分子结构。它在进化上结构很保守，在蛋白质磷酸化上具有重要功能。研究表明，STRIPAK调控一些重要的信号通路，比如，Hippo，MAPK,在核受体核细胞骨架重塑中也具有重要的调控功能。不同组成的STRIPAK复合物涉及广泛的生物学过程，从细胞生长，分化，增殖，凋亡到代谢，免疫调控，肿瘤发生。越来越多的研究表明，STRIPAK的失调能够导致很多疾病的发生，包括癌症。

在哺乳动物STRIPAK复合物中STRN家族蛋白作为丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP2A)的B调节亚基，一方面，通过PP2A支架亚基（A亚基，PP2A-a）募集PP2A催化亚基（C亚基，PP2A-c），另一方面，通过结合体包括CCM3，招募GCK。

一.拟研究或解决的问题

根据上海交通大学生命科学院下达的任务书，结合研究的现状，最终让学生掌握克隆，蛋白纯化和表达的基本技术，菌表达系统，昆虫表达系统和哺乳动物细胞表达系统，为今后的科研学习解

结构打下基础。 鉴于STRIPAK的重要生物学功能和生理功能，拟以STRIPAK复合物的三个亚基PP2A-A，PP2A-C，STRN3为材料，分别进行克隆，表达纯化，尝试进行探究三者相互作用，尝试在从菌到昆虫细胞到哺乳动物细胞的表达，甚至共表达，以便于为接下来的研究做铺垫。

二.采用的研究手段

1.分子克隆

对已有质粒PP2A-C，PP2A-A，STRN3采用PCR技术进行克隆。

2. 蛋白的表达，纯化

对克隆的质粒PP2A-C，PP2A-A，STRN3进行转化，在大肠杆菌中表达，提纯蛋白，过分子筛，跑胶，观察蛋白有无，纯度，尽量提纯进一步可尝试在昆虫细胞中表达，甚至在哺乳动物细胞中表达

3. 观察蛋白相互作用

选取两个蛋白一起过分子筛，观察蛋白的相互作用

三，参考文献

[1].Justice RW,Zilian O, Woods DF, Noll M, Bryant PJ(1995) The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation .Genes Dev 9:534-546

[2].Zeng Q, Hong W (2008)The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition, organ size control, and cancer development in mammals. Cancer Cell 13:188-192.

[3].Harvey K, Tapon N(2007)The Salvador-Warts-Hippo pathway-an emerging tumor-suppressor network.Nat Rev Cancer 7:182-191

[4].Pan D(2007)Hippo signaling in organ size control.Genes Dev 21:886-897

[5].Saucedo LJ, Edgar BA(2007) Filling out the Hippo pathway. Nat Rev Mol Cell Biol 8:613-621.

[6].Couzens AL, Knight JD, Kean MJ, Teo G,Weiss A, et al.(2013) Protein iteration network of the mammalian Hippo pathway reveals mechanisms of kinase-phosphatase interactions. Sci Signal 6:rs15.

[7].Huang J, Wu S,Barrera J, Matthews K, Pan D(2005) The Hippo signaling pathway coordinately regulates cell proliferation and apoptosis by inactivating Yorkie, the Drosophila Homolog of YAP. Cell 122:421-434

[8].Wang L, Chen Z, Wang Y, Chang D, Su L, et al.(2014) TR1 promotes cell proliferation and inhibits apoptosis through cyclin A and CTGF regulation in non-small cell lung cancer. Tumor Biol 35:463-468.

[9].Halder G, Johnson RL(2011) Hippo signaling : growth control and beyond.Development 138:9-22.

[10].Pan D(2010) The hippo signaling pathway in development and cancer. Dev Cell 19:491-505

[11].Yu FX, Guan KL(2013)The Hippo pathway:regulators and regulations.Genes Dev 27:355-371

[12].Lei QY, Zhang H, Zhao B, Zha ZY,Bai F, et al.(2008)TAZ promotes cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition and is inhibited by the hippo pathway. Mol Cell Biol 28:2426-2436

[13].Dong J, Feldmann G, Huang J, Wu S, Zhang N, et al.(2007) Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell 130:1120-1133

[14].Oh H, Irvine KD(2008) In vivo regulation of Yorkie phosphorylation and localization. Development135:1081-1088

[15].Hao Y,Chun A, Cheung K, Rashidi B,Yang X(2008) Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP.J Biol Chem 283:5496-5509

[16].Zhao B, Wei X, Li W, Udan RS, Yang Q, et al(2007)Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.Genes Dev 21:2747-2761

{17}.Zhang J, Smolen GA, Haber DA(2008)Negative regulation of YAP by LAST1 underscores evolutionary conservation of the Drosophila Hippo pathway. Cancer Res 68:2789-2794

[18].Bothos J,Tuttle RL, Ottey M, Luca FC, Halazonetis TD(2005) Human LATS1 is a mitotic exit network kinase. Cancer Res 65:6568-6575

[19].Liu CY, Lv X, Li T, Xu Y, Zhou X, et al. (2011)PP1 cooperates with ASPP@ to dephosphorylate and activate TAZ.J Biol Chem 286:5558-5566

[20].Yu FX, Zhao B, Guan KL(2015) Hippo Pathway Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell 163:811-828