开题报告内容：
- 实验背景
玉米是重要的粮食、饲料作物，重要的能源、食品和化工原料，作为中国乃至世界上种植面积最大、总产最高的粮食作物，在我国粮食生产中占有举足轻重的地位。玉米也是植物遗传学，特别是细胞遗传学、数量遗传学、转座子与突变和染色体重组等重要学科和学术研究的模式生物体。在玉米中，叶片作为光合作用的主要器官，对其生命活动有着重要作用，因植株叶色与叶绿体功能和植物发育密切相关，且叶色突变极易识别，而叶色突变体往往与叶绿素合成途径以及叶绿体的分化和发育有关，因此对叶色突变体的深入研究可以阐明光合作用调控机理和利用基因工程提高作物的光合效率，进而增加作物的产量具有重要的理论意义。至今已报道的与玉米叶绿素缺陷突变相关的基因有210 余个，在1～10 号染色体上均有分布( http: www．maizegdb．org) 。根据表型不同分为白化苗、黄化苗、条纹叶、斑点叶等。这些丰富的叶色突变材料为研究玉米中叶绿素相关代谢途径及叶绿体发育机制等提供了良好的材料基础。
图位克隆技术最早由剑桥大学的Alan Coulson提出，属于正向遗传学的范畴，以突变表型为切入点，根据功能基因在基因组中有相对稳定的基因座位，利用遗传标记对目标基因进行初定位的基础上，再通过染色体步移进行精细定位并克隆候选基因，最后通过遗传转化等实验对候选基因进行功能验证。
InDel即插入缺失标记，是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失,是同源序列比对产生空位 (gap)的现象。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。InDel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记,其本质仍属于长度多态性标记,可利用便捷的电泳平台进行分型。InDel标记准确性高、稳定性好,避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。InDel标记目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。随着位于功能基因上InDel标记的开发,结合染色体步移和基因精细定位,可将这些标记应用于相关物种经济性状的功能基因的筛选, 有利于优良基因的进一步开发和利用。
- 实验的目的与意义
本课题帮助学生熟练掌握突变材料的表型鉴定相关技术；了解分子标记开发相关软件与技术知识；掌握基因图位克隆常用技术，包括SDS-PAGE、PCR、DNA的快速提取、引物设计、琼脂糖凝胶电泳等分子生物学常用技术。实验室前期工作中筛选获得了一个玉米黄叶突变体Leaf-Y，经过近3年的田间种植与观察分析，发现其黄叶表型能够稳定遗传。利用该突变体与W64玉米自交系构建了F2分离群体，在F2群体中正常叶片植株与黄叶植株的分离比为3:1，chi;2检验表明其符合孟德尔遗传分离比，上述结果表明该黄叶表型是由单个核基因控制的隐性性状。
本实验上述研究基础上，对黄叶突变体Leaf-Y进行表型鉴定和基因的分子标记定位。具体包括以下几个方面：1）对突变体Leaf-Y进行系统的表型鉴定，明确突变体Leaf-Y与野生型的形态差异，分析造成其形态差异的组织学原因，为后续LEAF-Y基因的定位、克隆及功能分析奠定基础；2）对突变体Leaf-Y进行分子标记定位。首先利用Indel标记初步确认LEAF-Y基因在染色体上的大致范围，进一步开发新的标记，扩大定位群体将LEAF-Y基因定位在染色体上的某个区间内，为后续LEAF-Y基因的精细定位及候选基因的确认奠定基础。
本研究结果可为LEAF-Y基因的图位克隆、转基因功能互补验证和功能分析奠定基础，促进人们对玉米叶发育调控机制的理解，为进一步探讨叶色变异的调控机制提供了参考资料。
- 实验内容
以实验室前期获得的黄叶突变体Leaf-Y及构建的F2分离群体为材料，对突变体进行系统的表型鉴定和遗传学分析，利用正向遗传学手段，开发分子标记，对该基因进行分子标记定位与克隆。
1、玉米基因组DNA的提取
将获得的F2群体于二叶期选取突变的黄色幼嫩叶片，采用2times;CTAB法提取基因组DNA。
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