课题名称 LC/MS/MS法测定血和肝脏中4种癌症标志物
课题的背景和意义
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤。根据WHO的数据，目前HCC已经成为世界第三大致死疾病。HCC在东亚具有很高的发病率，肝硬化被认为是肝癌的一个主要危险因素【1】。HBV及HCV感染、黄曲霉毒素B1的暴露以及酒精的摄入也是较常见的危险因素【2】。在我国，肝癌病人约80％都伴有HBV感染【3】。尽管HBV致癌的具体机制目前还不明确，但是通常认为肝脏的慢性炎症坏死以及肝细胞的过度增生是主要的危险因子。HCC具有发生隐匿、恶性程度高、发展迅速、手术切除率低、复发转移早、临床预后差等特点。发现新的有效的HCC分子标志物将有助于HCC的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。而实验室前期工作加之文献查阅已经发现包括神经酰胺在内的四种肝癌标志物，故本课题在此基础上，建立LC/MS/MS测定四种癌症标志物的方法，有助于HCC的诊断和治疗【4】。
神经酰胺作为脂质第二信使，已经被证实具有很多生物学功能：(1)诱导细胞凋亡；(2)在细胞粘合、调节细胞免疫、决定血型及作为瘤抗原方面起着非常重要作用；(3)调节细胞分化、生长；(4)调节免疫功能和炎症反应等。在此，主要阐述诱导细胞凋亡的生物学功能。当细胞受到外界条件如紫外线照射、化疗药物、热击等各种刺激，细胞内神经酰胺的合成增加”，然后通过一系列信号转导途径诱导细胞凋亡。经酰胺作为鞘磷脂代谢的中心【5】，发挥着非常重要的生物学作用：细胞凋亡、抑制生长、细胞衰老等一系列的抗增殖反应。当细胞受到紫外线照射、热击、化疗药物等各种外界条件刺激后，内源性的神经酰胺开始合成并可能诱导细胞衰老、生长抑制、细胞死亡等一系列生理反应【6】。因此，神经酰胺被认为是一种可以抑制肿瘤细胞的脂质。另外，在神经酰胺代谢途径中相关的酶对肿瘤细胞的生长、生存有一定的调节作用。例如，人类N—SMase2酶对细胞生长和细胞循环具有重要的调节作用【7】。
选题现状
目前国内外已有多篇文献报道使用多种分析方法测定神经酰胺类物质的含量，主要有以下几种方法：
苯甲酰化－紫外检测法：利用苯甲酰化试剂与神经酰胺进行柱前衍生反应生成在230-280nm处有很强的紫外吸收的Ｎ－酰基化合物，从而实现对神经酰胺的间接紫外检测。具有很好的定量结果，检测灵敏度高，可达纳摩尔水平。衍生化过程繁琐、费时、操作条件要求高。 同时，衍生化产物稳定性较低，可能存在副产物的影响。
荧光标记－荧光检测法：通过一定的衍生化方法使样品对荧光敏感，从而实现对神经酰胺的间接荧光检测。与神经酰胺苯甲酰化－紫外检测法类似，荧光标记也具有很好的定量结果。衍生化过程比较繁琐和费时，而且副产物不能完全除去。
蒸发光散射检测法：ELSD是一种通用型质量检测器。 在检测过程中，将流动相完全挥发，然后测定留下来的样品颗粒的光散射。由于ELSD的响应值与被测物的质量相关，所以可以进行样品的定量分析。 由于操作过程中流动相完全挥发，所以基线平稳，ELSD已成为 HPLC中最常用的检测脂类方法。HPLC-ELSD系统可直接进行神经酰胺的定量分析，不需要任何的衍生化过程，从而避免了衍生化过程带来的误差。检测的响应值与被测物浓度的关系曲线比较复杂，并不是简单的线性关系。 分析时，需通过实验选择合适的标准物质定标，从而保证 ELSD对神经酰胺的定量检测的准确性。
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