开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题背景：乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其病死率位于各种癌症的前列。据文献报道，全球每年乳腺癌的新发病例约为105万例，每年因乳腺癌死亡的病例大约32.7万例。[1]研究表明在所有患乳腺癌的病人中，超过三分之二病例的的癌细胞具有荷尔蒙依赖性。[2]这些乳腺肿瘤含有高度表达的雌激素受体，肿瘤的形成、生长、增值需要雌激素的刺激。特别是绝经后妇女的乳腺肿瘤组织中，雌激素含量几乎保持和绝经前妇女一样的水平。因而，阻断雌激素的信号通路成为早期治疗乳腺癌的方法。20世纪70年代，他莫昔芬就作为雌激素受体抑制剂用于治疗乳腺癌[3]，但由于他莫昔芬能使局部雌激素增加而导致子宫内膜癌和血栓栓塞[4]，使其应用受到限制。
芳香化酶（aromatase,也即CYP19A），是体内负责雌激素生物转化的限速酶，它能将雄激素转化生成雌激素，如图1所示。因而通过抑制芳香化酶活性调剂雌激素在体内的合成,成为治疗乳腺癌的另一途径。20世纪70年代就报道了第一批具有芳香化酶抑制作用的化合物[5]。随后的研究发现，这些化合物对芳香化酶的选择性以及作用强度都不高。目前已有高活性和高选择性的第三代芳香化酶抑制剂被发现，其中已有3个化合物被美国FDA批准上市。已有实验数据证明对于绝经后妇女，单一芳香化酶抑制剂的治疗疗效优于他莫昔芬，因此，芳香化酶抑制剂的作用越来越受到重视。芳香化酶抑制剂现已成为绝经后乳腺癌患者术后内分泌治疗的一线药物，但是经过多年临床应用，其缺陷也日益突出，如部分患者无响应，出现耐药性、对某些CYP450酶具有抑制作用等不足之处迫切需要制药届研发新一代芳香化酶抑制剂加以完善。近年来，基于亲和色谱理论的固定化酶抑制剂筛选平台的构建得到快速发展，配体-受体相互作用模式有利于从复杂体系中筛选活性成分，尤其是复杂的天然产物体系。固定化酶优良的保存稳定性和重复使用性能解决游离酶在储存、回收方面的许多天然弱势。本课题通过共价键和和交联的方式合成固定化酶，然后通过比较各固定化酶的活力找到最优载体和桥连方式，为抑制剂的筛选找到最理想的载体。
研究手段：目前，酶的固定化方法主要有吸附法，共价结合法，包埋法及交联法四大法。
1．吸附法
吸附法主要是利用离子键、疏水相互作用、范德华力和氢键等相互作用将酶固定在载体上的一种方法。根据酶和载体之间结合力的不同,该法又可细分为物理吸附法和离子吸附法两种。物理吸附法主要以高吸附能力的非水溶性材料为载体,如硅藻土、分子筛、硅胶、多孔玻璃、氧化铝、大孔吸附树脂等;离子吸附法则是以含有离子交换基团的水不溶性材料为载体,利用酶与载体之间形成静电作用力来实现固定化,其常用载体有阴离子交换剂和阳离子交换剂。吸附法的突出优势在于工艺简单,操作条件温和，不易破坏酶分子的高级结构以及活性中心的构象,酶活回收较高;载体选择范围大且大多廉价易得,此外吸附过程有时还可同时达到酶纯化的目的。但这种方法的不足之处在于酶与载体之间的结合力较弱,酶容易从载体上脱落下来。由于大多数酶不溶于有机溶剂,而且许多情况下,酶分子和载体之间不需要很强的结合力,因此吸附法常用于非水相反应中固定化酶的制备。[6]
Blanco等人采用辛基三甲氧基硅烷修饰的介孔硅胶为载体对脂肪酶CandidQ Antarctica(type B)进行吸附固定化,结果表明,固定化酶的活力提高了10倍以上,在乙睛溶剂中催化乙醇胺与月桂酸的醋化反应时,重复利用15次,固定化酶活力基本保持不变.[7]Reshmi等人采用氧化铝对价淀粉酶进行吸附固定化,所制备的固定化酶与游离酶相比具有更高的pH稳定性.[8]张军等人分别以无机类的和有机类的18种材料为载体采用吸附法对脂肪酶进行固定化,其中无机类的载体包括硅藻土、英砂、硅胶G、活性氧化钙、碳酸钙、活性炭、皂土;有机类的载体包括琼脂粉,明胶、大豆蛋白和酸型及吸附型离子交换树脂等。研究结果发现,硅藻土是较好的载体,固定化后的脂肪酶醋化反应速率加快,吸附型树脂和皂土的效果次之。[9]
2.共价结合法
共价结合法是借助酶蛋白分子上的官能团和载体表面上的反应基团之间形成共价化学键而实现酶的固定化的一种方法。该法中经常采用的载体包括天然高分子材料(如纤维素、壳聚糖、淀粉、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物)以及人工合成高聚物材料(如尼龙、乙烯一顺丁烯二酸醉共聚物)等。共价结合法的优点在于酶与载体之间的结合力比较牢固,所制备的固定化酶通常具有良好的稳定性和重复使用性。然而,与吸附法相比,这种方法的反应条件较为苛刻,同
时由于发生了共价键结合,酶蛋白的高级结构容易产生变化,进而导致固定化酶的活力损失较大,甚至底物专一性等酶学性质发生改变。
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