Nrf2（NF-E2-related factor 2，转录因子NF-E2相关因子2）是亮氨酸拉链转录因子亚家族的成员，结构保守，分子量为66KDa。在细胞质中受一个69KDa的二聚化胞浆蛋白Keap1控制，催化其泛素化降解1。在氧化应激状态下，Keap1蛋白的半胱氨酸残基被烷基化或氧化导致Keap1-Nrf2复合物的构象变化，进而Nrf2的降解过程被干扰，新合成的Nrf2会进入细胞核结合小Maf蛋白2。最后二聚化的蛋白结合抗氧化反应元件（ARE），上调II相抗氧化酶的表达。
近年来关于Nrf2功能的报道有许多，从组织到器官包括肝脏、心脏、肾脏、结肠以及大脑3、4。Nrf2在细胞对抗外源有害物质和氧化应激中扮演了重要的角色，与众多疾病如炎症、心血管、恶性肿瘤及呼吸系统疾病有关5、6。在基因层面上，超过200种保护性基因如抗炎共刺激基因、抗氧化基因、分子伴侣和解毒酶基因的转录都受到影响7。在蛋白层面上，一系列下游保护性蛋白，包括醌氧化还原酶NQO1，血红素氧合酶HO-1、硫氧化还原蛋白Trxs及影响药物等外源性物质代谢的其它II相代谢酶类的表达均间接受到调节8。这些保护性的基因、蛋白由于其抗肿瘤、抗凋亡和抗炎症的能力可保护组织免受伤害。所以，针对Nrf2开发结构新颖、活性高的激动剂正逐渐成为研究重点及热点。
课题组前期采用HepG2-ARE-C8细胞的ARE荧光素酶报告基因方法，从组内化合物库中筛选得到了化合物DDO-7204，在20mu;M时达到4.100.35倍的ARE基因水平上调。DDO-7204激活Nrf2-ARE信号通路，上调NQO1、HO-1、gamma;-GCS等蛋白的表达。为了进一步提高DDO-7204激活Nrf2的活性，我们基于该化合物结构对SPECS数据库进行了虚拟筛选9，以期得到具有分子相似性的一系列结构。
DDO-7204作为模板分子在组内化合物库进行了分子相似性筛选。对于含有大量化合物的数据库，我们需要采用2D分子指纹FCFC_6方法（利用指纹信息寻找相似分子模块）来进行高效率的筛选。发现37104个分子和化合物DDO-7204具有相似性，但是如此大量的数据无法向后推进。考虑到在2D平面结构上，分子的空间结构信息大大减少，而3D构象的变化强相似性筛选不可进行，因此我们接下来使用的是基于形状的3D相似性筛选。程序输出最好分子，对其中具有1,2,4-恶二唑母核的分子经初步测试活性与DDO-7204相当。
之后挑选十个左右的分子进行Nrf2激动活性的测试评价。采用MTT（细胞抗增殖实验）、western blotting、细胞免疫荧光等手段，从细胞层面到蛋白层面到基因层面做出完整的评价10。
MTT实验：MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。操作流程如下：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细
胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
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