HPLC法测定养血生发胶囊中芍药苷的含量
一、论文研究的背景和意义
养血生发胶囊为广州白云山敬修堂药业股份有限公司生产的一种中成药，主要由熟地黄、当归、羌活、木瓜、川芎、白芍、菟丝子、天麻、制何首乌共9味中药制成，具有养血祛风，益肾填精的功效，用于血虚风盛，肾精不足所致的脱发，症见毛发松动或呈稀疏状脱落、毛发干燥或油腻、头皮瘙痒；斑秃、全秃、脂溢性脱发等病症[1]。方中白芍是较为重要的一味药，有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳的功能。芍药苷是白芍中的重要有效成分，测定芍药苷的含量可以有效控制养血生发胶囊的内在质量，为了更好地控制制剂质量，保证用药安全与有效，建立了高效液相色谱法，用于测定养血生发胶囊中芍药苷的含量[2]。
二、文献综述
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall．的干燥根，是临床常用中药，用于治疗血虚肝旺的眩晕、头痛，肝气不和的肋痛、腹痛、四肢痉挛、血虚萎黄、月经不调、自汗、盗汗等症[3]。其化学成分主要为单萜类、三萜类、黄酮类化合物等。按化学成分结构类型又可分为单萜及其苷类、三萜及其苷类、黄酮及其苷类、挥发油类及其他类化合物。白芍的含量测定一般以其主要成分芍药苷为指示成分。目前，对芍药苷的含量测定主要有高效液相色谱法、薄层扫描法及毛细管电泳法，本文采用的是高效液相色谱法。由于高效液相色谱法对样品的要求是能制备成适当的溶液，不需气化，加之分离效果很好、操作条件易稳定、分析速度快、应用范围广、检测灵敏度高、流动相选择范围宽、流出组分易收集、色谱柱可反复使用等优点，使其在中药制剂分析中的应用越来越广泛。常用的色谱柱为C18分析柱，检测器多用紫外检测器[4]。
在以高效液相色谱法测定芍药苷含量的实验中，有众多学者探讨了实验过程中影响芍药苷稳定性的因素，其中包括溶液PH、温度及光照等因素，通过对这些条件的控制，提高芍药苷稳定性，使实验结果得到改善。
解江纯、刘志东等在《芍药苷稳定性研究》中，采用高效液相色谱法在不同PH条件下，测定芍药苷在不同时间的含量变化，结果证明芍药苷在酸性条件下稳定，在碱性条件下随温度的升高，降解加速。由于芍药苷对碱性环境非常敏感，所以提取过程中应注意避免在碱性的条件下进行[5]。
闫兴丽在《乾坤清颗粒制剂工艺、质量标准及芍药苷稳定性的研究》中，论述了不同的温度及光照条件对不同形态芍药苷稳定性的影响。在不同的破坏性温度和时间下，分别测定白芍药材、白芍提取物、乾坤清颗粒成品中芍药苷含量的变化，结果为白芍药材有效期最长，白芍提取物相对白芍药材较短，乾坤清颗粒有效期最短。原因可能是白芍药材中的芍药苷存在于细胞中，固体状态下相对较稳定，受温度影响较小；而在白芍提取物中已从细胞中提取出来；乾坤清颗粒由于是复方制剂，成分比较复杂，受其它成分干扰所致。在光照影响试验中，将乾坤清颗粒、白芍药材、白芍提取物和芍药苷对照品开口放在装有日光灯的光照箱中，于温度4500lx500lx的条件下放置2、4、6、8、10天，取样，测定含量变化，结果得出芍药苷在不同存在形式下光照基本稳定，含量没有明显变化，提示光照的芍药苷的稳定性无影响[6]。
本实验中，除了控制好影响芍药苷稳定性的因素外，实验中芍药苷的提取过程和流动相的选择也至关重要，样品中的芍药苷是否提取完全直接影响到含量测定的结果，而流动相的选择影响峰形、峰面积等因子，从而影响含量测定的准确性，这两者决定着实验方法是否准确可靠。
凌宁生、孙婕以及李林写的《白芍中芍药苷测定方法的比较》中，分别从提取溶媒、溶剂体积、提取方法和提取时间这四个方面探讨了提取白芍中芍药苷的的重要条件。提取溶媒的考察：分别以甲醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇作为提取溶剂，结果得出50%的乙醇提取最完全；溶剂体积考察：分别为10ml的50%乙醇和25ml的50%乙醇提取，得出10ml的50%乙醇便可提取完全；提取方法考察：分别为水浴回流2h、浸泡24h、冷浸4h然后超声30min以及超声30min，所得结果得出超声30min为最佳方法；提取时间考察：分别超声20、30、40min，得出超声30min为最佳。文中还把含量测定时的流动相由药典中的乙腈-0.1﹪磷酸溶液（14:86）改为乙腈-水-冰醋酸（16:84:0.5），得到的结果较按《中华人民共和国药典》2000版一部所得结果理想[7]。
李冬雪、杜守颖等写的《对中国药典gt;2000年版Ⅰ部白芍中芍药苷含量测定方法的探讨》中，比较了《中国药典》方法和改进方法，采用70%乙醇为提取溶剂，流动相为甲醇-水（30:70），结果提取率高，测定准确，并可以减少有机溶剂对人的毒害和环境的污染[8]。
彭俊付、刘勇等写的《正交实验法优选广痛消中芍药苷的提取工艺》中，以芍药苷的含量为指标，采用L9(34)正交试验设计，对提取溶剂倍数、提取次数和提取时间3个因素（每个因素设3个水平）进行考察，结果为加8倍水体积，提取2次，每次1h时芍药苷提取量最大。2010年版《中华人民共和国药典》是用稀乙醇来提取白芍中的芍药苷，但广痛消是由8味中药组成的复方制剂，考虑到不同药材的成分、理化性质、用药的部位及药物之间相互作用，采用此方法制备样品，干扰较大。因此，实验中对提取溶剂进行了筛选，先后采用稀乙醇和蒸馏水对样品进行处理，发现水提能使广痛消中的芍药苷获得最佳分离[9]。
通过以上文献的论述，可以对养血生发胶囊中芍药苷含量测定的方法提供理论参考，从而改进实验方法，使实验结果得以优化。
三、论文的写作目标
通过实验，探讨养血生发胶囊中芍药苷含量测定的方法以及可能会影响实验结果的因素，旨在以芍药苷含量为指标来控制养血生发胶囊的内在质量，为养血生发胶囊现行的质量标准作补充，使其愈加完善。
四、写作方法
通过文献资料与实验操作相结合的方法
五、基本内容
研究对象：芍药苷
研究的问题和方法
1、养血生发胶囊中芍药苷的含量测定（按照《中华人民共和国药典》2010年版一部中白芍项下芍药苷含量测定的方法进行预实验）。
1.1色谱条件与系统适用性实验
以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈-0.1﹪磷酸溶液（14:86）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷的峰来计算应不低于2000。
1.2 对照品溶液的制备
取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60mu;g的溶液，即得。
1.3供试品溶液的制备
取本品中粉约0.1g，精密称定，置50ml量瓶中，加稀乙醇35ml，超声处理（功率240w，频率45kHz）30分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.4 测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10mu;l，注入液相色谱仪，测定，即得。
2、方法验证[10]
2.1 线性关系考察
精密吸取一系列芍药苷对照品溶液，制备5个不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件下测得峰面积，以峰面积积分值作为纵坐标，芍药苷浓度为横坐标作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。
2.2 稳定性试验
取同一供试品，在规定的不同时间间隔内进样测定，芍药苷峰含量应基本不变。
2.3精密度试验
精密吸取相同量的同一供试品溶液， 重复进样6次，测定其峰面积，计算RSD。
2.4 重复性试验
在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价；或设计3个不同浓度，每个浓度各分别配制3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价。
2.5 回收率试验
在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价；或设计3个不同浓度，每个浓度各分别配制3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在1:1左右。
回收率﹪=（C-A）/B*100﹪
式中 A为供试品所含被测成分量；
B为加入对照品量；
C为实测量。
六、写作步骤
2013.2.25-2013.3.15 查阅文献，结合公司日常实验寻找课题；
2013.3.16-2013.3.30 确定课题，提交开题报告，具体规划实验；
2013.3.31-2013.5.31 着手实验，论文撰写及修改。
参考文献：
[1] 郑丽娜，任海勇，张作平，孙蓉，HPLC法测定养血生发胶囊中二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的含量 [J].中国药物警戒，2011,8（4）：199-201.
[2] 杨丽萍，艾萍，李泽琳，李霄，白芍及其制剂质量控制方法研究进展[J].时珍国医国药，2010,21（10）：2640-2041.
[3] 郑世存，李晓宇，欧阳兵，孙蓉，芍药苷药理作用研究新进展[J].中国药物警戒，2012,9（2）：100-103.
[4] 莫可丰，白芍芍药苷含量测定方法的研究[J].广西中医药,2003,26(2):6-7.
[5] 解江纯，刘志东，田慧，王颖，芍药苷稳定性研究[J].天津中医药,2010,27（4）：344-345.
[6] 闫兴丽，乾坤清颗粒制剂工艺、质量标准及芍药苷稳定性的研究[D].山东：山东医药工业,2003:1-55.
[7] 凌宁生，孙婕，李林，白芍中芍药苷测定方法的比较[J].中草药，2004,35（12）：1372-1373.
[8] 李冬雪,杜守颖,贾海英，吴清，郑海云，对《中国药典》2000年版Ⅰ部白芍中芍药苷含量测定方法的探讨[J].时珍国医国药，2005,16（4）：311-312.
[9] 彭俊付，刘勇，刘永刚，正交实验法优选广痛消中芍药苷的提取工艺[J].北京中医药大学学报，2011,34（4）：271-273.
[10] 黄坤龙，李华，HPLC法测定追风透骨丸中芍药苷的含量[J].中药新药与临床药理，2002,13（3）：178-179.
资料编号：[391977]
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