GLP-1受体激动剂促成骨作用研究文献综述

一 项目的立项依据及研究设想

1、航天飞行或失重（缺乏负荷）环境对人体造成的影响是多方面，可以导致许多脏器长期或短期的功能异常，如体液重新分布、肾小球滤过增加、心血管功能改变、肌肉萎缩、骨质丢失、代谢紊乱、免疫功能的改变等，其中失重所致宇航员失重性骨质疏松是航天事业所面临的最严重的医学问题，也是长期太空飞行最大的障碍[1]。失重性骨质疏松是失重环境引起的一种特殊的废用性骨质疏松，是航天员长期太空飞行面临的亟待解决的医学难题之一。失重或模拟失重状态下，骨矿化及骨重建发生紊乱，导致骨钙丢失。航天飞行研究显示航天员空间飞行6个月引起跟骨宽频超声衰减值降低13.2%，胫骨的松质骨和皮质骨的含量减少4.5%和2.9% [2]，承重骨每月平均骨钙丢失约0.6 %，骨密度每月降低1.0 %~1.6 %，丢失速率远大于妇女绝经后每年的骨丢失率[3-4]。失重导致骨骼结构功能变化主要表现为骨量减少、骨骼脱矿、骨密度降低、骨脆性增加和骨生物力学性能下降，返回地面后恢复也比较缓慢, 甚至相当困难，从而导致骨折发生的危险性增高[5]。失重状态下骨质丢失呈进行性改变，中长期飞行会严重影响骨骼的结构和功能，今后载人航天任务主要是建立空间站和到其他星球探测，航天员在太空中停留的时间越来越长，失重引起的骨骼系统改变将严重地影响航天员的健康和工作能力，成为影响长期载人航天发展的主要障碍之一。因此，探索和研发防治失重性骨质疏松的新策略和新药物成为当今航天医学研究领域迫切需要解决的重大问题。

2、我们在前期研究中发现，在尾悬吊致大鼠失重性骨质疏松模型上，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂Exendin-4能显著增加尾悬吊所模拟的失重性骨质疏松大鼠的骨密度，降低骨脆性，提高骨的生物力学特性，并改善骨小梁微结构；同时检测到反映骨形成的生化指标血清ALP和OCN显著升高，提示Exendin-4通过促进成骨形成而发挥抗失重性骨质疏松的作用。此外，在MC3T3-E1细胞上观察到，GLP-1/ Exendin-4能够增加ALP的分泌，并增强细胞的矿化功能。提示GLP-1/Exendin-4通过促进成骨细胞分化增殖功能、增加骨形成而发挥抗失重性骨质疏松作用，但是对于间充质干细胞及成骨细胞的作用以及他们受体的表达情况还不是很明确。

3、为明确GLP-1受体激动剂对成骨细胞的促成骨作用，我们将在离体细胞及分子水平上对GLP-1受体激动剂的促成骨作用做系统的研究，发现促进成骨形成的药物作用新靶点，提供防治失重性骨质疏松的新策略和新药物。

二 国内外研究现状及发展动态分析

1.、现有治疗药物对失重性骨质疏松的治疗作用有限，寻找药物作用新靶点成为研究的重点和热点

骨骼系统的不断自我更新和改建称为骨重建，骨重建过程主要通过骨重建单位（bone remodeling unit，BRU）的破骨-成骨的偶联作用完成的，即在系统和局部的骨生长调节因子的作用下，成骨细胞的分泌基质、基质矿化促进钙沉积的作用（骨形成）和破骨细胞的促进钙游离、释放的作用（骨吸收）处于动态平衡。如果成骨细胞的骨形成作用大于破骨细胞的骨吸收作用就表现为骨量增加，反之则表现为骨量减少，严重的骨量减少就会导致骨质疏松（osteoporosis）[6]。骨质疏松的主要特征是骨量减少、骨组织显微结构退化，导致骨脆性增加，极易发生骨折。目前临床上治疗骨质疏松的药物根据其机理主要有两大类[7]，分别是：① 骨吸收抑制剂，如钙制剂、双膦酸盐类、雌激素及选择性雌激素受体调节剂、维生素D及活性代谢物、降钙素等。骨吸收抑制剂是目前治疗骨质疏松的主要药物，然而此类药物主要通过抑制破骨细胞的骨吸收作用，延缓骨量丢失，对于已经丢失的骨组织无作用，不能有效的增加骨密度、改善骨结构、降低骨折发生的风险。而失重性骨质疏松是以成骨细胞形成抑制为主要特征，现有的骨吸收抑制剂对其疗效十分有限。② 骨形成促进剂，如甲状旁腺激素。人重组甲状旁腺激素rhPTH(1-34)（Forteo，特立帕肽）是现今市场上唯一的骨形成促进剂，但由于其具有患高钙血症和骨肉瘤的危险，因此大大限制了该药的应用[8]。目前已有许多措施被尝试用来对抗航天飞行中失重引起的骨质疏松，包括摄入足够的饮食、摄入足够的钙和维生素D、口服用于抗骨质疏松药物（如双膦酸盐）等，但对于航天飞行或卧床试验导致的骨质疏松并无明显疗效[9,10]。因此，寻找促进骨形成的药物作用新靶点，将是防治失重性骨质疏松新药研发领域重要的突破口及新趋势。

2、失重状态下骨形成抑制是失重性骨质疏松发生的主要原因

骨形成包括BMSCs分化为成骨细胞和成骨细胞成熟为骨细胞两个过程。BMSCs首先定向分化为骨祖细胞，然后分化成前成骨细胞，最后分化为成骨细胞。骨祖细胞还可以分化为前软骨细胞系，骨祖细胞接近骨表面时演化为具有分泌、合成胶原基质的前成骨细胞；前成骨细胞定向分化为成骨细胞，具有很强的合成和增殖能力；在分化终末阶段，成骨细胞被包埋于矿化的骨基质中成为骨细胞。成骨细胞的成熟过程包括成骨细胞增殖、胞外基质成熟和胞外基质矿化等阶段。能够反映成骨细胞分化表型特征的I型胶原（collagen I）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）等基因，分别在成骨细胞的增殖、基质成熟和矿化阶段优势表达[11]。在整个骨组织的发育、形成和重建过程当中，成骨细胞担当着极其重要的作用，不仅负责骨基质的合成、分泌和矿化和骨组织的骨量，而且负责调节破骨细胞的生成和活性。成骨细胞分泌的RANKL和OPG是骨代谢最主要的调节因子，也是破骨细胞分化和功能调节的重要因子，RANKL和破骨细胞前体细胞的RANK结合而启动破骨细胞分化过程，OPG可以和RANKL结合而影响其与RANK结合，抑制破骨细胞前体细胞向破骨细胞的分化[12]。

大量研究数据显示太空失重环境骨代谢平衡紊乱，骨形成抑制，是导致骨量快速丢失的重要原因。模拟失重状态抑制了BMSCs向成骨细胞分化，并促进其向脂肪细胞分化[13]，成骨细胞分化标志分子碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和Runx2表达明显降低，而脂肪细胞特异分子如脂肪细胞转录因子PPAR_gamma;的表达明显增加[13,14]，表明失重状态下BMSCs向成骨细胞的定向分化功能受到抑制；在地面模拟失重条件下培养的小鼠前成骨细胞MC3T3的分化功能受到抑制，成骨细胞晚期转录因子osterix及骨钙素的表达显著下降[15]，导致成成熟的骨细胞数量减少，矿化结节形成减少；失重条件下成骨细胞内与G1/S期转化相关的cyclin E mRNA下调，使细胞不能进入S期而停滞在G1期晚期，细胞增殖受到明显抑制[16]，并且成骨细胞出现大量凋亡[17]。同时失重条件下成骨细胞RNAKL表达增加而OPG的表达降低，使RANKL/OPG的比例增加，从而促进破骨细胞的分化，继而导致骨吸收增强[14]。因此失重状态下BMSCs及前成骨细胞分化功能降低，成骨细胞增殖及矿化功能障碍、凋亡增加，成熟成骨细胞的数量减少，导致骨形成抑制、骨基质成熟障碍，是失重性骨质疏松发生的根本原因。

3、 肠道激素在维持正常骨量和骨重建平衡中发挥重要的调控作用

GIP、GLP-1和GLP-2是三种具有重要生物学作用的肠道激素，均有肠道细胞分泌，三者被认为是体内最重要的肠促胰岛素，除了具有降低过高血糖、促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、刺激胰岛beta;细胞增殖等治疗糖尿病的作用外，在维持正常骨量和骨重建平衡中也发挥了重要的作用。研究发现短肠综合征患者给予GLP-2治疗后，骨丢失明显减轻，骨质疏松症状得到显著改善[18]；绝经后妇女给予GLP-2治疗后，Ⅰ型胶原C末端肽（骨吸收指标）显著降低，而骨形成指标骨钙素并未受到影响[19]；进一步研究发现，是由于破骨细胞上存在GLP-2受体，GLP-2与受体结合，抑制了骨吸收作用[20]。GIP可直接作用于成骨细胞上的GIP受体，促进成骨细胞的增殖、抑制其凋亡[21]；也可以作用于破骨细胞上的GIP受体，抑制甲状旁腺激素诱导的骨吸收过程[22]。但是GLP-1在骨代谢中的作用研究却相对较少，有研究显示GLP-1受体基因敲除小鼠（Glp-1r -/-）骨吸收作用增强[23]；在葡萄糖耐受不良大鼠给予GLP-1治疗后，不仅能改善葡萄糖耐受不良的情况，还可以改善大鼠的骨质结构[24]；我们的前期研究发现，Exendin-4能够显著尾悬吊大鼠的骨质疏松症状，骨密度增加、骨生物力学性能改变，成骨标志性分子血清ALP和OCN显著升高，并显著增强MC3T3-E1的增殖及矿化功能，提示Exendin-4可能通过促进骨形成发挥抗骨质疏松作用。但是GLP-1在骨代谢中促进骨形成的调节机制却并不清楚。目前为止，虽然在成熟的成骨细胞和破骨细胞上均未发现GLP-1受体，但是最新研究发现在BMSCs和未成熟的成骨细胞（前成骨细胞）上存在GLP-1受体[25-27]，所以本课题中我们提出设想，认为GLP-1作用于BMSCs和前成骨细胞上的GLP-1受体，促进BMSCs的向成骨分化，刺激前成骨细胞的分化和增殖功能，从而发挥促成骨作用。

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三 研究内容

观察GLP-1/Exendin-4对原代成骨细胞功能的影响：

1、原代成骨细胞的分离、培养及鉴定：分离大鼠颅骨成骨细胞，体外成骨诱导培养，分离、碱性磷酸酶染色法鉴定。

2、观察GLP-1/Exendin-4对原代成骨细胞分化功能的影响：不同浓度GLP-1/Exendin-4处理，检测Runx2、Osterix及ALP、COL1、OCN的表达，分析GLP-1/Exendin-4对成骨细胞分化进程的影响；

3、检测增殖细胞核抗原PCNA表达，并应用MTT法分析GLP-1/Exendin-4对成骨细胞增殖能力的影响；

4、茜素红染色进行矿化结节计数，计算矿化率，分析GLP-1/Exendin-4对成骨细胞矿化功能的影响；

5、流式细胞仪检测检测细胞凋亡率，GLP-1/Exendin-4对成骨细胞凋亡的影响。

四 实验方案（技术路线图，设计依据，指标选择，实验目的）

试验方法

B. 成骨细胞的分离、培养及鉴定：用酶消化法进行成骨细胞体外原代培养，将新生SD大鼠处死，置于75%乙醇中浸泡消毒5min，无菌条件下取出颅骨，于预冷的PBS缓冲液中去除软组织等，将骨片剪碎后依次用1mg/ml Ⅰ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶消化，37℃消化30min。如此消化3次，收集第2、3次的消化液，1000 rpm离心3~5 min，细胞用含15%胎牛血清的alpha;-MEM培养液分散接种，细胞贴壁铺满后用碱性磷酸酶染色法鉴定成骨细胞。此时分离的成骨细胞多为未成熟的前成骨细胞，需进行诱导培养方能分化成为成熟的成骨细胞。

C.成骨细胞的诱导培养：取第三代的成骨细胞诱导分化培养，培养液换成含10 mM beta;-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C的诱导培养液。

2、观察GLP-1/Exendin-4的促成骨形成的疗效

A. Real-time PCR法检测BMSCs和成骨细胞中成骨相关基因Runx2、ALP、COL1、OCN等的表达变化：BMSCs和成骨细胞经诱导培养7~28天后，于不同时间点提取细胞总RNA，按细胞总RNA提取试剂盒说明书进行，随后Real-time PCR操作同前。

B. 免疫荧光检测PCNA表达：将细胞接种于预先放置盖玻片的24孔板内，待细胞生长融合至80%时，取出细胞爬片，加入4%多聚甲醛固定30min，0.5%TritonX-100透化，5%BSA封闭非特异性抗原，滴加1：100稀释的PCNA一抗，4℃湿盒孵育过夜，加入1：100稀释的FITC标记的二抗，37℃湿盒避光孵育1h，而后用DAPI复染细胞核，PBS冲洗，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察照相，采用Image ProPlus图像处理软件进行分析，以细胞的平均荧光灰度值代表PCNA表达水平。

C. MTT法测定细胞增殖能力：将细胞接种于96孔板，孵育24h细胞贴壁后给予药物处理，分别培养24、48和72 h，每个浓度和时间点均设3个复孔。于终止前4h将培养液更换为无血清的、含0.25 mg/ml MTT的alpha;-MEM培养液，培养箱孵育4h，弃去上清后每孔加入100mu;l二甲基亚枫（DMSO），室温下避光作用2h，待细胞上吸附的紫色结晶溶解完全，用酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，测定波长为490 nm。

D. 茜素红染色法分析细胞的矿化能力：成骨诱导的过程后期即成骨细胞矿化期，细胞分泌的胶原纤维与钙盐亲和，以钙盐的方式沉淀下来，形成结节状，茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的化合物，钙结节由于富含钙，因此被染成了深红色，该染色法是测定成骨细胞矿化能力的特异性方法。于细胞诱导培养14、21、28天，弃培养液，PBS洗3次，每次5min，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，每次5min，0.1%的茜素红染液（pH 8.0）37℃染色1h，PBS洗3次，每次5min，显微镜下观察结果、计数并进行统计学分析。

E. 流式细胞术测定细胞凋亡率：细胞干预培养72 h后，胰蛋白酶常规消化，制成细胞悬液，PBS洗涤3次，细胞悬浮于70%冰乙醇中，4℃固定过夜，1500 rpm，离心5 min，PBS洗2次。DNA染色液（其中包含50 mu;g/ml RNA 酶，0．1%TritonX-100，0.1 mmol/L、pH7.4的EDTA和50mu;g/ml PI）重悬，4℃ 避光染色30min，流式细胞仪检测细胞凋亡。考察mSMS对胰岛细胞株（INS-1）胰岛功能紊乱的改善作用

五 拟解决的关键性问题

确证GLP-1对失重性骨质疏松的促成骨形成作用。

六 可行性分析

(1) 理论可行：申请者所在课题组近年来一直从事GLP-1在相关性代谢疾病的分子机制及药物研发方面的研究，前期在GLP-1药物研发方面已取得了一定进展，部分实验结果已在国内外的期刊上发表。在此基础上申请者详尽调研了当前国际关于失重性骨质疏松的发病机制及其防治策略现状，认识到现有的防治失重性骨质疏松的药物及其有限，且疗效不明显，在航空事业迅猛发展的今天寻找防治失重性骨质疏松的新策略和新药靶刻不容缓。因此本课题是立足于课题组自身的研究基础上、着眼于失重性骨质疏松防治领域的新热点提出的，是原有研究的延伸和拓展，具有坚实的理论和工作基础，有明确的目标性和可行性。研究方案参考相关研究文献报道，并经课题组反复推敲讨论，逻辑严密，切实可行。

(2) 工作基础扎实：本课题所采用的动物实验方法、细胞生物学方法和分子生物学方法均为成熟的实验方法。我们课题组目前已经建立了大鼠尾悬吊模型，课题组成员已经熟练掌握了BMSCs的分离纯化及鉴定方法、成骨细胞原代培养方法、细胞回转器培养方法、细胞转染技术、Real-time PCR方法和Western-blot方法，为本课题的顺利实施提供了坚实的技术保障。

(3) 研究团队实力较强：本课题组的成员均经过良好的实验研究训练，有丰富的研究经验，熟练掌握了细胞培养、动物实验、细胞转染及与分子生物学实验方法等本课题相关的所有实验技术。本课题成员组成具有较好的学科交叉融合条件，完全具备承担本项目的能力。

(4) 实验研究条件完备：本教研室具备Roche Cobas Integra 400 Plus全自动生化分析仪、恒温培养箱、Nikon荧光显微镜、Real-time PCR仪、Beckman J-6高速低温离心机、蛋白质电泳及湿转仪、Bio-rad酶标仪、AlphaImager凝胶成像分析系统、荧光分光光度计、紫外分光光度计等设备，本校兄弟科室还拥有GE eXplore Locus SP Micro-CT、Leica 2500硬组织切片、MTS BioNix 858 II 型万能材料试验机、流式细胞仪等完成本课题所需的所有设备和条件，可以保证本课题的顺利实施。