开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
巨噬细胞至少可以被分为两种类型:M1型，即经典活化的巨噬细胞 ( Classically activated macrophage)和M2型，即替代性活化的巨噬细胞( Alternatively activated macrophage ) o M 1型巨噬细胞在细菌或其产物脂多糖( Lipopolysaccharides, LPS)或干扰素-y ( Interferon-y, IFN-y)的诱导下产生，表现为:高递呈抗原的能力;高分泌白细胞介素12 ( Interlukin-12, IL-12 )和白细胞介素23 ( Interlukin-23 , IL-23)及其随后诱导的I型免疫应答;高产生毒性中间产物[一氧化氮(Nitric oxide, NO )，活性氧中间产物(Reactive oxygen
intermediates, ROI )]的能力。因此，M1型巨噬细胞被认为具有杀伤细菌和肿
瘤细胞并可以分泌多种促炎性细胞因子的能力。而M2型巨噬细胞可由白细胞介素4 ( Interlukin-4, IL-4 )、白细胞介素13 (Interlukin-13} IL-13)、糖皮质激素、转化生长因子一p( Transformating growth factor-p，TGF-p)和前列腺素E2( Prostaglandin E2, PGE2 )等诱导产生，表现为:低的递呈抗原的能力;产生抑制细胞增殖和活性的细胞因子，如白细胞介素10 ( Interlukin-10, IL-10 );较好的清除碎片的能力;促进血管生成和创伤愈合的能力。
恶性肿瘤具有极大危害性，对其发生发展机制的研究一直是人们关注的重点。已有的研究认为在肿瘤局部微环境中，多数浸润的细胞发生了表型和功能的改变，介导了促肿瘤的效应。越来越多的证据表明：肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophage，TAM）在长期肿瘤微环境下，逐渐形成了独特的表型，同时功能上也发生了显著的改变。目前认为，巨噬细胞根据活化状态和发挥的功能主要可分为M1型，即经典活化的巨噬细胞（Classically activated macrophage）和M2型，即替代性活化的巨噬细胞（Altematively activated macrophage）。M1型巨噬细胞可通过直接或分泌多种促炎性细胞因子杀伤病原体和肿瘤细胞；而由IL-4、IL-13、糖皮质激素、TGF-beta;和前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）等诱导产生的M2型巨噬细胞，表现为较低的抗原提呈能力，并可通过分泌抑制性细胞因子如IL-10、TGF-beta;等下调免疫应答。
TAM的表型特征及其与M1型和M2型巨噬细胞的相互关系，目前尚未得以完全明确。Mantovani等根据人甲状腺乳头状癌和卵巢癌等研究结果，曾指出TAM可能发生替代性活化，呈现出M2型巨噬细胞的表型。然而，至今尚未得到相应的实验充分证明。为了深入研究浸润肿瘤局部的巨噬细胞类型和功能，我们初步用小鼠原代培养的巨噬细胞以及鼠源巨噬细胞株RAW264.7研究巨噬细胞表型转化及其机制。
巨噬细胞原代培养的方法：1 原理 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠 10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡 1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台 手术刀 解剖剪 解剖镊 止血钳 5m注射器 注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理： (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。 (2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。 (3)将新生小牛血清200m1，在56℃水浴中灭活30分钟，按10%的浓度分别加入培养液中备用。 4．2巨噬细胞的获取 4.2.1 以颈椎脱臼法处死小鼠。 4.2.2 手提鼠尾将其全浸入75%乙醇中5min，倒立小鼠并向腹腔内注射预冷至4℃PRMI1640培养液5ml（注意针尖勿伤及内脏），仰卧平放并轻揉小鼠腹部2～3min，静置5～7min。 4.2.3 置小鼠于解剖台，用针头固定四肢，在腹股沟区作一横切口，撕裂皮肤以完全暴露出腹膜壁， 但勿伤及腹膜壁。用75%酒精冲洗腹膜壁 4.2.4 用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动，并 促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表面释放，形成细胞悬液。 4.2.5用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 4.2.6小心拔出针头，把腹腔液注入预冷的培养瓶内。 4.2.7常规计数细胞。每只鼠可产生2~ 3106/ml细胞，其中90%为巨噬细胞 。取少量细胞悬液做Giemsa染色，在光镜下观察以鉴定是否是巨噬细胞。 4.3巨噬细胞的纯化将细胞悬液于4℃、1000r/min离心10min,弃上清,放入培养瓶中，将培养瓶中细胞用4℃D-Hanks液洗2次,再用RPMI1640培养液于37℃、5% CO2 下培养2h,弃上清,用D-Hanks液洗涤2次以洗去未贴壁细胞,贴壁的细胞则主要是巨噬细胞。然后换下培养用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液培养继续培养，此时将得到接近纯净的巨噬细胞。 4.4巨噬细胞的接种和培养 将纯化的巨噬细胞培养瓶快速冷冻至2℃，待细胞收缩后猛摇或吹打培养瓶，使巨噬细胞从瓶壁上脱落下来（Castranova et al.1996）。制成细胞悬液后，计数并调节细胞密度。以2105 ～4105个/cm2的密度接种细胞于12孔培养板内，加入适量RPMI1640培养液后置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次液，以备用。 4.5巨噬细胞的鉴定 取培养板内任意一孔细胞用Gomori酸性磷酸酶（ACP）铅法染色，细胞呈阳性反应，ACP活性颗粒呈棕黑色，则可以断断是巨噬细胞，光镜下计数200个细胞求出阳性率。 4.6巨噬细胞吞噬功能的检测: 在巨噬细胞接种和培养过程中，取适量巨噬细胞悬液放入培养瓶中，加入1%鸡红细胞悬液,37℃孵育2h,甲醇固定细胞涂片,吉姆萨染色,显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况。计数100个巨噬细胞,计算吞噬率和吞噬指数。 吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100(所观察的巨噬细胞数) 100%。 吞噬指数=100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数/100(所观察的巨噬细胞数)。
巨噬细胞表型转化鉴定及其方法：根据已有的文献，我们选用了LPS作为了M1型巨噬细胞的诱导剂，IL-4作为M2型巨噬细胞的诱导剂，在体外诱导M1型和M2型巨噬细胞。以未处理的RAW264.7细胞作为对照，我们对在体外诱导的M1型和M2型巨噬细胞用
检测巨噬细胞膜分子CD163的表达、用试剂盒及ELISA检测IL-10,IL-12,NO和Arg-1 (Arginase-1，精氨酸酶一1)等的表达。
参考文献
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
