研究问题
构建透明质酸/聚酰胺-胺/质粒DNA三元纳米复合物,并研究其作为基因靶向递送载体的可行性。
研究手段
HA/PAMAM/质粒DNA以不同比例在水中自动组装形成纳米复合物；激光粒度分析仪测纳米复合物的粒径和电位；原子力显微镜观察纳米复合物形态；凝胶电泳阻滞实验确定聚阳离子完全结合包裹DNA所需要的N/P；利用绿色荧光蛋白报告基因和荧光素酶报告基因来考察三元纳米复合物的体外细胞转染；CCK8法测三元纳米复合物的体外细胞毒性。
文献综述
肿瘤严重威胁人类健康,目前手术切除、化疗和放疗依然是临床最主要的治疗方法，然而对于中晚期的癌症患者效果并不理想。近年来，随着生物技术的发展，基因治疗肿瘤得到越来越多的重视。基因治疗是指将外源基因通过载体递送到患者的肿瘤部位，增强抑癌基因表达或抑制癌基因表达来治疗肿瘤[1,2]。基因载体的选择是治疗获得成功的重要因素。基因治疗的载体分为病毒型载体和非病毒型载体，病毒载体是将病毒的致病序列通过重组技术替换为外源基因。病毒载体转染效率很高，但是严重的免疫反应阻碍了其在人体内的应用。非病毒载体是一类阳离子聚合物，虽然其转染效率不如病毒载体，但是其基因容量大，生物相容性好，无免疫源性等优势使其成为目前研究的热点[3,4]。
聚酰胺-胺（Polyamidoamine，PAMAM）树枝状高分子是近年来出现的一类新型纳米级的高分子材料，呈单分散性，其末端氨基丰富，在溶液中带正电荷，可以吸附压缩DNA/RNA等带负电荷的核苷酸，形成纳米复合物，防止核苷酸被酶降解。PAMAM的转染效率与其代数有密切关系[5]，代数越高，分子量越大，在一定范围内转染效率也增大。然而高代数的PAMAM的细胞毒性较大，主要是由于其表面高密度的正电荷与细胞表面的负电荷相互作用，在细胞膜表面形成孔洞，最终造成细胞凋亡。因此，载体材料的最终选择需在细胞毒性和转染效率之间达到平衡[6]。综合文献报道，5代的PAMAM可以较好的平衡基因转染效率、细胞毒性等各方面因素，是较为理想的高分子基因载体[7]。
透明质酸(Hyaluronicacid，HA)，又名玻尿酸，是一种线性大分子酸性粘多糖。由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成[8]，HA大量存在于哺乳动物骨髓细胞外基质和疏松结缔组织中。HA带负电荷，具有良好的生物相容性、生物可降解性、无免疫原性，以及对肿瘤细胞的高亲和性等特点，能够屏蔽阳离子载体的正电荷而降低其细胞毒性[9]。HA有重要的生物学功能，高分子质量的HA在疏松结缔组织中有维持细胞完整性，保持细胞外基质水分的作用，它可分解为寡糖小片段，参与受体介导的细胞内信号转导。HA受体CD44和HA介导能动性受体RHAMM在多种肿瘤细胞表面过表达，可以与HA发生特异性结合。利用HA水溶性和肿瘤细胞靶向性的特点，将其修饰药物载体已成为抗肿瘤药物研究热点之一[10]。
本课题以树状高分子材料PAMAM为载体，质粒DNA作为报告基因，用HA作为靶向头基，乳腺癌细胞高表达的CD44受体作为靶向位点。通过三者之间电荷吸附构建HA/PAMAM/DNA三元纳米复合物，并研究其作为基因靶向递送载体的可行性。
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