K阿片受体激动剂高通量筛选模型的建立
一.实验目的：
通过建立高通量筛选模型，筛选出有效的K阿片受体激动剂，用于治疗心率失常以及止痛方面新药的开发研究。
二.实验背景：
kappa;阿片类受体属于G蛋白偶联受体家族成员之一。k阿片受体主要分布于大脑皮层、伏隔核、屏状核和下丘脑，与疼痛、利尿和神经内分泌调节等相关。到目前为止，大多数的研究已经表明，kappa;阿片受体激活后可以改变心脏功能。KOR激动剂能抑制心肌肥厚和心肌纤维化，减少缺血再灌注心律失常的发生率，还可以抑制体外心肌细胞肥大。只有少数的研究已经表明，kappa;阿片受体与疼痛相关。根据大量的文献研究，我们可以得出，kappa;阿片受体激动剂与mu;阿片受体激动剂相比，在降低呼吸抑制率、低成瘾性和依赖性、并在吸毒者的阶段治疗等方面具有优势[16-17]。因此，寻找有效的kappa;阿片受体激动剂可能为治疗疼痛提供一种新的方法。
kappa;阿片类受体受体激活后与Gi/Go型G蛋白偶联，抑制腺苷酸环化酶活性，降低细胞内cAMP的水平，从而抑制蛋白激酶A及其最蛋白质磷酸化的调控作用。
三.研究原理及方法：
在本研究中，我们使用LANCEcAMP测定法对化合物进行筛选，以得到有效的kappa;阿片类受体激动剂。这种方法是一种基于细胞水平的高通量筛选方法，它可以在活细胞内研究药物对机体功能的影响，能较为准确地反映出药物的生物学作用，因此在近年的新药研发中逐步受到重视[3]。它同时也是一种均相时间分辨荧光共振能量转移的分析方法，可以检测G蛋白耦联受体调控下由于AC活性变化而产生的cAMP水平变化。此测定方法是基于Eu标记的cAMP示踪剂复合物与样本cAMP对染料AlexaFluor647标记了的cAMP特异性抗体的结合位点进行竞争结合。biotin-cAMP和streptavidin标记的Eu紧密结合，形成Eu标记的cAMP示踪剂复合物。当抗体与Eu-SA/b-cAMP示踪剂结合，340nm处的激光激发Eu-chelate分子发出的能量，被转移到Alexa分子上，从而发出665nm的荧光，荧光强度与样品中cAMP浓度成反比。
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