自然人噬菌体单链抗体文库的构建和鉴定
一、课题研究的主要目的和意义
自从1975年Kohler和Milstein开创杂交瘤技术生产单克隆抗体(McAb)以来，使体外制备针对某一特定抗原决定簇的高亲和性抗体成为可能[1]。虽然杂交瘤技术制备的单克隆抗体纯度均一、特异性强、亲和力高，但是也存在一些难以克服的缺点，如由于技术的限制很难制备出人源性单克隆抗体，由于免疫耐受机理很难获得自身抗原的单克隆抗体等。20世纪90年代，组合化学技术与基因工程抗体技术相结合产生了抗体库技术。抗体库技术是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。从抗体库中可以筛选出多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体，这些显示出抗体库技术的应用潜力[2,3]。
与传统杂交瘤技术相比，抗体库技术无需免疫，从理论上讲，108的库容就可能包容所有的抗体。利用抗原即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选到针对该物种自身抗原的抗体[4,5]。
将抗体的多样性可变区基因组装到表达载体内，表达到噬菌体表面，得到多样性噬菌体抗体的集合即为噬菌体抗体库[6]。噬菌体抗体库技术的产生是基于以下实验技术的发展：PCR技术的发展使人们可以用一组引物(免疫球蛋白可变区中骨架部分的保守序列)，通过RT-PCR直接从总RNA克隆出全套免疫球蛋白可变区基因。大肠杆菌可以将有抗体活性的免疫球蛋白分子片段分泌入周质腔。噬菌体展示技术的建立。即将抗体基因插入到丝状噬菌体衣壳蛋白基因中。使抗体基因对应的表达产物融合在噬菌体衣壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，形成含有全套抗体谱的噬菌体抗体库，进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体，是噬菌体抗体库技术的核心。
根据构建抗体库的基因来源不同，可以将噬菌体抗体库分为合成抗体库、免疫抗体库以及天然抗体库[7,8]。免疫抗体库的抗体基因来源于经过某种抗原免疫的已分化的B细胞，与天然抗体库相比，免疫抗体库更易于获得针对该特定抗原的有较强的抗原特异性和亲和力的抗体。天然抗体库的抗体基因来源于未经免疫的动物或人体B细胞，理论上能含有所有抗体基因的多样性，可以同时针对多种抗原进行筛选。
不可否认，噬菌体抗体库技术已显示强劲的发展势头，它的价值不仅仅在于抗体的制备，其强大的筛选能力已广泛地应用到免疫学、细胞生物学、药理学、蛋白质工程等诸多领域。后基因组时代的到来，就是研究蛋白质的结构、功能及其相互作用，噬菌体抗体库技术能提供此项技术平台。但人们需要进一步解决的问题是构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库使其库容和多样性不下降和新筛选方法的建立。相信随着此项技术的不断完善，将会有一个广阔的诱人的前景。
本研究构建天然人源单链抗体噬菌体展示文库作为通用的技术平台，用于多种抗原的筛选天然单链抗体噬菌体展示文库的构建。天然抗体库的抗体基因来源于未经免疫的动物或人体B细胞，理论上能含有所有抗体基因的多样性，可以同时针对多种抗原进行筛选。收集200份正常人的外周血，分离淋巴细胞，提取细胞总RNA逆转录cDNA，分别以抗体重链VH及抗体轻链VL系统性引物扩增得到全套抗体重，轻链基因。纯化回收PCR产物,通过酶切、连接分别将轻、重链的酶连产物插入到噬菌体载体中，通过大量多次电转化，铺板刮细菌保存轻、重链库。
二、课题研究试验方案
1）利用淋巴细胞分离液分离正常健康人外周血淋巴细胞；
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