985磷酸化多克隆抗体纯化及检测文献综述

 2023-01-09 17:52:02
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

985磷酸化多克隆抗体纯化及检测

拟研究或解决的问题

  1. 熟悉抗体研究的一般流程。
  2. 研究了Elisa 分析抗体纯度的方法。
  3. 研究了抗体效价的检测方法。
  4. 对方法中的一些关键条件进行考察。
  5. 用建立的方法对本品进行研究，找出最优实验条件。

采用的研究手段

根据对方法中一些关键性条件的考察，结合磷酸化多克隆抗体的结构性质，对其进行纯度分析并优化分析方法。

  1. 研究材料及仪器设备

电子天平，离心机，树脂柱， pH计，分光光度计，试剂及试验样品均由吉尔生化（上海）公司提供。

  1. 研究方法及试验步骤

2.1 溶液配制

配制TBS缓冲液、PBS缓冲液、EA平衡液、EA保存液、甘氨酸洗脱液PH2.5、甘氨酸洗脱液PH3.0、Bingding Buffer、6M盐酸胍、叠氮钠10%。

2.2实验方法

2.2.1将设计好的985多克隆抗原乳化后进行动物实验（采用兔子实验）。

2.2.2抗体鉴定

抽取血样用Elisa实验分析动物是否发生抗多肽反应。

2.2.3抗体的提取

取兔子全部血样然后离心得到血清，透析纯化。

2.2.4抗体的纯化

偶联多肽制作亲和层析柱：磷酸化及非磷酸化亲和层析柱。

Elisa法纯化多克隆抗体先用非磷酸化纯化柱纯化，再用磷酸化纯化柱纯化。

2.2.5抗体效价检测

稀释纯化后的多肽用Elisa检测从酶标仪上得到数据。

2.2.6多克隆抗体的包装和发货了解

本课题工作进度

第1-3周 确定论文题目，撰写开题报告

第4-7周 开始实习工作，同时完成学校分布的任务，写好实习周记，并搜集论文所需资料。

第8-12周 根据收集的资料，完成初稿，并交指导老师修改，完成二稿

第13-14周 根据指导老师的意见，修改二稿，并由指导老师再次修改，完成三稿。

第15周 完成论文定稿与装订

第16周 毕业论文答辩

学生签名： 年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室审查意见：

负责人签名： 年 月 日

填写说明

1.指导教师意见填写对文献综述的评语，对本课题的深度、广度及工作量的意见和对论文结果的预测；

2.所在教研室审查意见包括对指导教师意见的认定和是否同意开题等。

文献综述

985磷酸化多克隆抗体纯化及检测

学号:1144109 姓名:王家晨

摘要

本文指出了985磷酸化多克隆抗原的乳化方法及动物实验、抗体的获得及用Elisa法进行检测和纯化讨论了该方法的类型、过程机理和描述方法，在此基础上，对该方法在重组磷酸化多克隆抗体类药物的研究前景进行了展望。

关键词 磷酸化多克隆抗体；动物实验；抗体纯化；纯度分析；抗体检测；Elisa

前言

针对一个底物磷酸化和去磷酸化状态下的磷酸化位点而生产的抗体，这样利用底物磷酸化和去磷酸化时和抗体结合型的改变来研究底物是否被磷酸化，从而研究蛋白活性的变化。免疫原经过磷酸化，用其制备的抗体就称之为磷酸化抗体。多克隆抗体是由异源抗原（大分子抗原、半抗原偶联物）刺激机体产生免疫反应，有机体浆细胞分泌的一组免疫球蛋白。多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应，制备时间短，成本低的原因广泛应用于研究和诊断方面。而磷酸化的多克隆抗体可以更加方便的对抗体进行检测和性质研究。

Elisa法即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。

我们通过Elisa法来检测985磷酸化多克隆抗体的获取、纯化及检测，熟悉抗体获得及检测的一般手法及实验技巧。

主题

酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

1.1历史发展

自从Engvall和Perlman(1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但酶联免疫吸附试验专用仪器随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。

如今ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。

1.2 ELISA方法的基本类型、用途及操作程序

根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的 ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；再一类是采用疏水性聚脂布作为载 体的ELISA，称为布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心 ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。

间接ELISA

本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下。

⑴ 材料

  1. 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；
  2. DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；
  3. ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。

⑵ 方法步骤

  1. 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
  2. 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
  3. 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
  4. 加底物液　→ 37℃ 30分钟，加终止液
  5. 用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。

⑶ 结果判定　已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）ge;2.1，而且已知阳性血清的OD值ge;0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）ge;2.1，而且待检血清的OD值ge;0.4，则判为阳性，否则判为阴性。

双抗体夹心

本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。

  1. 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
  2. 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
  3. 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
  4. 加底物液　→ 37℃ 15分钟，加终止液
  5. 用ELISA检测仪测定OD值。

双夹心ELISA

此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为：

  1. 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
  2. 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
  3. 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
  4. 加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
  5. 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
  6. 用ELISA检测仪测定OD值。

竞争ELISA

此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为：

  1. 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
  2. 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
  3. 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
  4. 用ELISA检测仪测定OD值。

被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。

阻断ELISA

本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：

  1. 100mu;l AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
  2. 用200mu;l阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
  3. 加工作量1:4稀释被检猪血清100mu;l → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
  4. 加100mu;l工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
  5. 加100mu;l工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
  6. 加100mu;l OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
  7. 用ELISA检测仪测定OD值。

本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。

抗体捕捉ELISA

本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：

  1. 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干
  2. 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
  3. 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
  4. 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
  5. 用ELISA检测仪测定OD值。

斑点ELISA

与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：

  1. 载体膜的预处理及抗原包被　取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cmtimes;2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20mu;l。
  2. 封闭　将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
  3. 加被检血清　可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。
  4. 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。
  5. 显色　加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。
  6. 结果判定　以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。

布ELISA（C－ELISA）

　C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大学者Blais,B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：

  1. 首先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；
  2. 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；
  3. 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；
  4. 加入底物液显色；
  5. 测定OD值。

2、现状分析

ELISA由于其高度的重现性、灵敏度和较短的分析时间所决定其应用的广泛性.ELISA原则上用于检测抗原、抗体及半抗原,在实际应用中可作疾病临床诊 断与监察、食品中有害成分残留的测定、与基因工程合并使用等,ELISA的应用具有广阔的发展前景。

  1. 趋向预测

1 ELISA技术的发展趋势
酶联免疫吸附试验（ELISA）在医院实验室中应用之广泛是其它试验无可比拟的。它是一项基本的，常规的，也是一项成熟的检测技术。90年代以来，随意免 疫荧光法，化学发光法，电化学发光法的等应用，特别是以PCR（聚合酶链反应）技术为代表的分子生物学水平技术的应用，人们纷纷预测；ELISA技术将被 更高，更灵敏的试验方法所取代。但是由于免疫标志物（抗原/抗体）具有无法替代的临床意义，以及ELISA技术具有操作简便，技术可靠，试剂方便易得等优 点，特别是90年代以来ELISA技术的灵敏度和特异性都得到了显著的提高与完善。由此，ELISA技术得到了人们的认可，成为传染病学（肝 炎，HIV，TORCH等），肿瘤标志物以及内分泌等各种临床免疫指标检测的不可替代的主导技术。
2 ELISA全过程自动化的意义
随着实验室从化验 检验 医学检验 检验医学的发展，酶免检验已成为医学领域中一门重要的学科，参与临床诊断，治疗及疗效判断等工作。众所周知，ELISA过程具有反应时间长而要求严格，步 骤多而复杂。因此，就一项具体的酶免试验而言其试验过程与完成时间是不可改变和缩短的。但对于多项目的批量标本处理时，总体的试验时间将大大缩短。据报道 （美国临床病理学院的调查报告），实验室误差产生原因79%的因素是因为实验过程中标本处理不当以及人的为的因素而造成的。所以酶免试验全过程的意义不仅 仅在于降低了实验者的劳动强度使人们从“机械”的实验中解放出来，而且根据已发表的文献研究报告：全自动酶免分析系统可以普遍地，显著地提高酶免实验的特 异性及试剂的灵敏度，降低了人为因素造成的误差。为了提高实验室检验质量，更好的为病人服务，承担更多的检验项目更复杂的标本来源与实时工作模式，酶免实 验室的自动化与标准化已成为全面实验室自动化发展的需求，同时也给实验室带来了新的优势和利益。

同时ELISA试验受诸多因素影响。其中试剂盒的质量以及操作者的水平将直接影响到这一过程的成功与否。因此在完全按照试剂盒要求的前提下，均一，稳定的操作 过程和试验条件是获得最佳试验结果的必要条件。而全自动酶免分析仪避免了常规程序的局限性，集加样，孵育，洗板，比色于一体。极大的消除了人为因素带来的 误差，使试验的灵敏性，重复性以及特异性同时有所提高。所以，全自动酶免分析仪符合现代化实验室的要求，也是现代化医院实验室的发展趋势。

参考文献

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资料编号：[386234]

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