一．拟研究的问题 程序性死亡受体配体1 (programmed death ligand 1, PD-L1) 是一种参与免疫抑制通路的分子, 在较多实体肿瘤细胞及其周围T淋巴细胞表面显著表达, 能够与其受体程序性死亡受1（PD-1）结合, 抑制肿瘤组织周围的免疫微环境, 促使肿瘤细胞逃避免疫监视作用[1]。
PD-L1被证实在乳腺癌细胞中异常表达[2]，研究PD-L1的调控机制可为PD-L1提供一种新的解决问题的方法，miRNA近年来在乳腺癌中的研究越来越多，找到一种miRNA对PD-L1的有效控调节研究很有必要。
本课题旨在探索miR-873-5p对于乳腺癌中PD-L1的调控机制。
二．实验主要内容本实验的研究包括以下几项内容：1.采用数据库预测PD-L1与miR-873-5p的可能结合位点2.miR-873前体序列的载体的构建及测序3.PD-L1的3UTR的构建（与hsa-miR-873-5p的结合位点）4.PD-L1的3UTR结合位点突变的载体的构建5.miR-873-5p对PD-L1表达的调控三．实验方法1.采用数据库预测PD-L1与miR-873-5p的可能结合位点随着miRNA研究的逐渐加升，已有很多的网站可以用来预测miRNA与目的基因的可能结合位点，包括3UTR和5UTR。
其中以3UTR更为常见。
我们已知的有miRNAWalk2.0，TargetScan,microRNA.org等等，采用更为全面的预测方法找出靶向PD-L1的miRNA，预测二者的结合位点，为后续载体的构建准备2.miR-873前体序列的载体的构建及测序在miRbase网站中找到初级hsa-miR-873-5p的发夹结构，从NCBI上找到hsa-miR-873-5基因，在发夹结构的基础上找出其上下游各200bp的序列，将这段hsa-miR-873-5p的序列构建到PLVX-IRES-ZSGreen1的带绿光载体上。
采用Primer5.0设计引物，找出合适酶切位点及保护碱基，然后进行高效的目的基因的扩增、酶切、酶连方法将大约500bp的目的基因克隆到载体上，选用活性较高的DH5ɑ感受态作为重组片段的导入菌，等到平板上的单克隆长出后，挑取单菌落送去测序。
3.PD-L1的3UTR的构建（包含hsa-miR-873-5p的结合位点）在NCBI上找到hsa-miR-873-5p的3UTR序列，验证是否包含结合位点，以pMIR-Report Luciferase为克隆载体，其余步骤和方法参考2.2。
4.PD-L1的3UTR结合位点突变的载体的构建在已经构建好的PD-L1 3UTR的基础上把潜在的结合位点进行合适的碱基突变，对于结合位点的突变我们可以采用传统的重叠延伸PCR进行目的序列的突变，也可以采用快捷的突变位点酶试剂盒高效的突变自己想要的结果。
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