新型抗肿瘤肽的设计、合成与初步生物活性研究文献综述

一、 课题来源及选题依据，着重说明该课题在国内外研究动态及对该课题开展研究工作的设想，以及将在哪些方面有所进展或突破。

肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病，其主要表现为机体内异常细胞的增值失控，并且可向正常组织或器官转移^[1]。统计表明，全球因肿瘤疾病致死人数比例占死亡总人数的1/8。化疗作为肿瘤疾病治疗的重要手段之一，在治疗过程中，面临化疗药物产生的严重毒副作用这一临床应用的巨大弊端。同时，肿瘤细胞对化疗药物耐药性的产生也是导致化疗失败的主要原因之一^[2]。因此，寻找选择性好，且不易诱导细胞耐药性的新型抗肿瘤药物是当前研究的热点问题。

细胞穿透肽（cell-penetrating peptides，CPPs）又称蛋白转导域（protein transduction domains，PTDs），通常是由30个或更少氨基酸残基组成的具有细胞穿透能力的小分子多肽，在较低浓度下，通过内吞作用穿过细胞膜进入细胞，不会对细胞膜造成明显损伤或破坏，并且能介导各种药物包括抗癌药物、核酸、蛋白多肽以及纳米粒子等进入细胞^[3]。CPPs主要可以分为阳离子型、两亲性型和疏水型三大类。其中阳离子CPPs一般结构中含有大量碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸等），带有较多的正电荷^[4]。由于肿瘤细胞与正常细胞存在着一定的差异，在一定程度上CPPs能够特异性地与肿瘤细胞结合。从代谢方面来看，肿瘤细胞由于缺氧发生无氧糖酵解，产生乳酸累积，导致局部呈现酸性，而正常细胞在氧的参与下能将葡萄糖彻底氧化分解，产生二氧化碳和水，周围环境呈中性；从细胞结构观察，肿瘤细胞与正常细胞的细胞膜组成存在着较大的差异，肿瘤细胞的细胞膜主要由富阴离子分子组成，如磷脂酰丝氨酸，O-糖基化的粘蛋白（由高含量的带负电荷的丝氨酸和苏氨酸组成的高分子糖蛋白），神经节苷脂，乙酰肝素硫酸盐等，致使细胞表面带负电荷，而正常哺乳动物细胞的细胞膜主要由中性的两性离子磷脂和固醇组成。由于CPPs与肿瘤细胞之间通过静电相互作用而结合，肿瘤细胞难以对CPPs产生耐药性^{[5, 6]}。因此，CPPs在抗肿瘤领域有着广阔的应用前景。p14ARF是一种非常有效的肿瘤抑制物，其N端22个氨基酸组成的多肽含有20%精氨酸，符合阳离子CPPs的一些序列特征，该肽不仅保留p14ARF的细胞毒性，并且具有一定的穿透作用，其穿透能力与已知的穿透肽Transportan10相当。受其启示，我们计划对高效低毒的CPPs进行结构改造，在不影响其穿透作用的前提下，进一步的增强其抗肿瘤活性。

BP16（H-KKLFKKILKKL-NH₂）是从天蚕抗菌肽-蜂毒肽的杂交肽库（cecropin-melittin hybrids，CECMEL11）中筛选出的对肿瘤细胞无毒，但具有较强细胞穿透作用的细胞穿透肽。与带电中性的哺乳动物细胞膜相比，BP16能更强地作用于带电负性的细菌细胞膜上。因此我们推测，BP16与细菌细胞膜的这种电荷作用，可以应用于细胞膜带负电荷的肿瘤细胞上^[7]。本论文通过调研文献总结CPPs与抗肿瘤多肽的关系，选用BP16作为先导物，通过进一步的结构改造设计合成新型的抗肿瘤多肽，期望解决其代谢稳定性差，体内半衰期较短的缺点。并进行生物活性的初步评估，望得到保留其穿透活性，选择性更好且半衰期有所延长的新型抗肿瘤多肽分子。

图1 先导肽BP16分子结构

二、 课题在理论或实际应用方面的意义、价值及可能达到的水平，同时对课题工作计划、技术路线、实验方案、预期结果等，做初步分析和论证。

1、课题的研究内容

1.1新化合物的设计与合成

调研文献通过对抗菌肽（AMPs）的研究中发现，脂肪酸链与两亲性的AMPs结合后，可使其二级结构稳定性增强，同时脂肪酸-肽缀合物也表现出比母体肽更佳的抗菌活性，与细胞膜的结合更加紧密。此外，对于大多数多肽类药物而言，代谢稳定性差，体内半衰期较短^[6]。通过脂肪酸的引入，可增强其与血清白蛋白的结合率，进而改善多肽的血浆稳定性，延长半衰期。因此，我们分别在多肽氨基末端引入不同长度的脂肪酸。同时考虑到脂肪酸或胆固醇基团的引入可能对BP16构象造成一定影响，我们又在BP16末端引入双甘氨酸连接臂（Gly-Gly），避免结构变化对构象的影响。在此，我们设计一系列BP16脂肪酸类衍生物（I-1~I-10）。

图2 目标化合物的结构

1.2 化合物的生物活性测定

1.2.1体外细胞毒研究；

1.2.2蛋白结合率及血浆稳定性研究。

1.3对化合物进行深入的构效关系讨论

2、研究方案（技术路线、实验方案和方法和手段、预期研究目标、研究条件，实验过程中可能遇到的问题及拟解决方法）

2.1总体技术路线：

2.2化合物的合成

2.2.1多肽链的合成路线

我们将采用Rink树脂，微波辅助固相合成通法合成肽链，合成C端氨基修饰的BP16肽粗品。合成得到的粗品的分离纯化采用制备HPLC方法。

化合物合成路线如下：

(a) 0.1mmol/L HOBt, 20% Piperidine/DMF (v/v); (b) Fmoc-Val-OH, HBTU, HOBt, DIPEA; (c)选用有关Fmoc保护的氨基酸重复该过程; (d) 0.1mmol/L HOBt, 20% Piperidine/DMF (v/v); (e)切割剂TFA/TIS/H₂O (95:2.5:2.5, v/v)

2.2.2多肽衍生化合成路线

脂肪链类化合物合成方法：中间使用相应的氨基酸进行偶合反应。而在多肽N端引入脂肪酸结构，其偶合方法与肽键形成方法类似。

化合物合成路线如下：

(a) 0.1mmol/L HOBt, 20% Piperidine/DMF (v/v); (b) Fmoc-Val-OH, HBTU, HOBt, DIPEA; (c)选用有关Fmoc保护的氨基酸重复该过程; (d) 0.1mmol/L HOBt, 20% Piperidine/DMF (v/v); (e) 正癸酸, HBTU, HOBt, DIPEA; (f)切割剂TFA/TIS/H₂O (95:2.5:2.5, v/v)

2.3 生物活性测定

2.3.1体外细胞毒实验（MTT实验）

贴壁细胞：（1）胰酶消化对数生长期细胞，中止消化后离心收集细胞并制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度为5-610⁴个/mL，在96孔板中每孔加入100 mu;L细胞悬液，边缘孔用无菌PBS填充。（2）5% CO₂，37℃条件下孵育24 h后，加入浓度梯度的药物。一般而言，药物浓度设置5-7个梯度，每孔100 mu;L，并设置5个复孔。（3）5% CO₂，37℃条件下继续孵育24 h，并可通过倒置显微镜观察药物作用效果。（4）每孔加入20 mu;L MTT溶液，继续孵育4 h。若药物能与MTT反应，需弃去培养液，PBS清洗2-3次后再加入含MTT的培养液。（5）取出96孔板，小心弃去孔内液体。（6）每孔加入150 mu;L DMSO，并将96孔板置于摇床上低俗振摇10 min，待紫色结晶充分溶解后，通过酶标仪检测490 nm或570 nm波长下的OD值。（7）实验中设置调零孔和对照孔。

悬浮细胞：（1）直接收集对数生长期细胞，离心后并制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度为5-610⁴个/mL，在96孔板中每孔加入100 mu;L细胞悬液，边缘孔用无菌PBS填充。（2）5% CO₂，37℃条件下孵育24 h后，加入浓度梯度的药物。（3）5% CO₂，37℃条件下继续孵育24 h，并可通过倒置显微镜观察药物作用效果。（4）每孔加入20 mu;L MTT溶液，继续孵育4 h。若药物能与MTT反应，需离心后（1000 g 5 min）弃去培养液，PBS清洗2-3次后再加入含MTT的培养液。（5）取出96孔板，离心后（1000 g 5 min）小心弃去孔内液体。（6）每孔加入150 mu;L DMSO，并将96孔板置于摇床上低俗振摇10 min，待紫色结晶充分溶解后，通过酶标仪检测490 nm或570 nm波长下的OD值。（7）实验中设置调零孔和对照孔。

抑制率(%)＝(OD空白孔-OD加药孔)/(OD空白孔-OD校零孔)100%。依据公式，得出不同浓度化合物对细胞的抑制率，并用GraphPad Prism 6.0软件计算各化合物的IC₅₀值^[7]。

2.3.2蛋白结合率及血浆稳定性研究

血清白蛋白结合实验

清洁级别SD大鼠（雄性，体重200 20 g），购自扬州大学比较动物中心。大鼠采血前禁食12 h（不禁水），乙醚麻醉后，通过股动脉取血。血液收集至含抗凝剂的采血管中，3000 g 15 min离心，移取上清液，即得血浆，-20℃保存备用。多肽经过纯化后采用PBS缓冲液配成0.2 mg/mL的初始母液，取250 L的化合物溶液与等体积大鼠血浆涡旋混匀， 37C水浴温孵，并分别于0, 15, 30 min和1, 2, 4, 6 h时间点进行检。通过加入1.5 mL含有0.1% TFA的乙腈沉淀，涡旋3 min，10000 g15 min离心后，取上清液直接进行UPLC-MS分析。记录不同时间点的质谱峰面积数值，绘制降解曲线^[8]。

3.预期研究目标

调研文献总结CPPs与抗肿瘤多肽的关系，选用BP16作为先导物，通过进一步的结构改造设计合成新型的抗肿瘤多肽，并进行初步生物活性评估，期望通过脂肪酸的引入，增强其与血清白蛋白的结合率，进而改善多肽的血浆稳定性，延长半衰期。

4.研究条件

本项目的化合物设计合成具有充分的依据（见实施方案及工作基础部分），其合成路线及合成方法经过反复研究和探索，基本上切实可行。另外，本项目是在本课题组已有的工作基础上进行继续研究，所用的试剂较为常规，这为结构改造工作提供了保障。

　1) 利用单模微波辅助固相合成技术（CEM的多肽合成系统），快速合成目标多肽。

2) 准确测定目标化合物体外血浆的稳定性。

3) 研究并总结化合物的构效关系，为进一步的化合物设计提供依据。

6.参考文献

[1] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation [J]. Cell, 2011, 144(5): 646-674.

[2] Stratton MR, Campbell PJ, Futreal PA. The cancer genome [J]. Nature, 2009,458(7239): 719-724.

[3] Copolovici DM, Langel K, Eriste E, et al. Cell-penetrating peptides: design, synthesis, and applications [J]. Acs Nano, 2014, 8(3): 1972-1994.

[4] Johansson HJ, Elandaloussi S, Holm T, et al. Characterization of a Novel Cytotoxic Cell|[hyphen]|penetrating Peptide Derived From p14ARF Protein [J]. Molecular Therapy the Journal of the American Society of Gene Therapy, 2008, 16(1): 115.

[5] Lohrum MaE, Ashcroft M, Kubbutat MHG, et al. Contribution of two independent MDM2-binding domains in p14(ARF) to p53 stabilization [J]. Current Biology, 2000, 10(9): 539-542.

[6] Midgley CA, Desterro JM, Saville MK, et al. An N-terminal p14ARF peptide blocks Mdm2-dependent ubiquitination in vitro and can activate p53 in vivo [J]. Oncogene, 2000, 19 (19): 2312-2323.

[7] Jones LL, Chaturvedi V, Uyttenhove C, et al. Distinct subunit pairing criteria within the heterodimeric IL-12 cytokine family [J]. Molecular Immunology, 2012, 51(2): 234-244.