开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
谷氨酸介导着大脑和脊髓绝大多数的兴奋性传递，是哺乳动物神经系统中主要的兴奋性递质，储存于突触前囊泡中，以钙依赖的方式释放。中枢神经系统（central nervous system，CNS）内存在着与谷氨酸结合并发挥生理效应的两类受体，即离子型谷氨酸受体（ionotropic glutamate receptors, iGluRs）和代谢型谷氨酸受体。iGluRs，为具有阳离子透过性的离子通道受体，可以分为三种：N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体、KA受体和AMPA受体。其中NMDA受体具有复杂的分子结构和独特的药理特性，除在神经元的发育如树突、轴突的发育，神经元存活中有重要作用外，还与突触的可塑性相关，进而参与了学习、记忆等过程，同时还与兴奋性毒性造成的神经元死亡相关，因此在CNS功能中担任重要角色。
近年来对NMDRs的研究表明，NMDARs亚基组成的不同会产生不同的生理及药理活性。从组成上看，NMDARs是由不同亚基构成的异四聚体（heterotetramers），其有七个不同的组成亚基，可以分为三种，即GluN1、GluN2和GluN3。GluN1又有8种不同的亚单位（GluN1-1a/ b-4a/b），它们由同一基因编码，由于剪切部位的不同而生成；GluN2有4种不同的亚单位，即GluN2A-2D，来源于四种不同的基因；GluN3有两种亚单位，GluN3A和GluN3B，由两个独立的基因编码。在哺乳类动物的神经组织内，功能性NMDA受体至少含有两个GluN1亚基和一个GluN2亚基。一般认为，NMDA受体是由两个GluN1亚单位和两个GluN2亚单位构成的异四聚体，其中的两个GluN1亚单位和GluN2亚单位可以相同亦可不同。在表达GluN3亚基的细胞，一般认为此亚基与GluN1和GluN2亚基组装在一起，形成GluN1/GluN2/ GluN3的聚合体。
从结构上看，NMDARs可以分为四个结构域，N端，激动剂结合域，跨膜域及与下游信号通路相关的C端。其中激动剂结合域上有多种配体结合的位点， 它们以亚型选择的方式控制着受体的活动，如位于GluN1的甘氨酸结合位点，位于GluN2的谷氨酸结合位点，二者的结合控制着NMDAR离子通道的开放。此外，还存在一些离子通道的孔隙以及N末端的变构结合位点，它们都参与调节了NMDAR离子通道的正常开放和功能。
NMDA受体广泛存在于大脑皮层、海马等区域，以海马CA1区和皮质最多。一般认为，NMDA受体主要分布在神经细胞的突触后膜。在兴奋性神经元，NMDA受体主要分布在树突棘头的突触后膜，且主要分布在突触后致密区（postsynaptic density, PSD）。但近年来的研究显示，NMDA受体不仅存在于突触后膜，还存在于突触前膜。不仅分布于突触后致密区，还分布于PSD的周围或非突触胞膜上。位于突触后致密区以内的NMDA受体被称为突触后NMDA受体（synaptic NMDAR），树突棘上突触后致密区周围的NMDA受体被称为突触周NMDA受体（perisynaptic NMDAR），经常也被称为突触外NMDA受体（extrasynaptic NMDAR）。
大脑高级功能主要由皮层执行，皮层NMDA受体主要由含有GluN2A或含有GluN2B两种亚型构成。两种亚基构成的受体分布和功能有所不同，其中GluN2A-containing NMDAR主要分布在突触上，与神经元的存活相关， GluN2B-containing NMDAR主要分布在突触外，其激活可引起神经元兴奋性毒性，从而造成神经元的死亡。在一些神经系统疾病中这两种NMDA受体的功能有较为明显的差异。例如，在中风和TBI中，NMDAR依赖性兴奋性中毒似乎是缺血或损伤后急性发生的神经元死亡的主要原因，并且NMDAR阻断剂在体外和体内保护神经元抵抗缺血性细胞死亡。GluN2B-NMDARs的过度激活可能导致缺血性细胞死亡，而GluN2A-NMDARs的活性可能促进缺血性损伤后的恢复；在亨廷顿症（HD）中，NMDARs在纹状体中等多棘神经元（MSNs）中高度表达，纹状体中的主要神经元群体在HD中退化。将GluN2B过表达小鼠与HD模型小鼠杂交会加剧MSNs的死亡，因此，突触外GluN2B-NMDAR可以在HD中的神经元细胞死亡中发挥重要作用；在阿尔兹海默症（AD）中，人们普遍认为可溶性寡聚形式的淀粉样蛋白-beta;（Abeta;）扰乱突触功能和可塑性，进一步的证据表明Abeta;主要影响突触外NMDARs，这主要是含有GluN2B亚基的NMDA受体，因此，通过测试GluN2B拮抗剂的长期给药是否在AD的动物模型中有益，解析GluN2B-NMDAR对AD的作用将是重要的。在抑郁症中，非选择性NMDAR拮抗剂氯胺酮在患有治疗性耐药性抑郁症的人类患者中产生的抑郁症状，可迅速（数小时内）和持续减少（数天）。有趣的是，在相同的动物模型中，GluN2B拮抗剂引发了类似的信号传导途径，并且也表现出抗抑郁作用，表明抑制GluN2B-NMDARs的活性可以解释大部分氯胺酮的抗抑郁作用。同时，也有研究发现，GluN2A基因敲除小鼠表现出明显的抗抑郁样和抗焦虑样行为，这表明GluN2A亚基可能与抑郁的发生也有潜在的联系，但具体机制并不清楚。
由此可见，GluN2A和GluN2B在中枢神经系统中其功能上可能存在极大的差异。GluN2A和GluN2B都是通过其C terminus 与相关蛋白相关作用进而激活下游信号通路，但与二者相互作用蛋白有何不同，以及他们激活的是何种下游信号通路而导致功能上的差异是不清楚的。这一问题的阐明，可以进一步加深对NMDAR功能的了解，也可以为探究NMDA受体异常和疾病的关系奠定基础。因此我们将主要利用BioID技术，研究GluN2A和GluN2B下游相互作用蛋白的不同，进一步探究这两种受体的功能，及其在神经环路中发挥的作用。
本实验利用的BioID技术，即一种用于筛选活细胞中生理相关蛋白之间的相互作用的技术。该技术利用一种混合的生物素连接酶，通过该突变连接酶（命名为BirA 2）与目的蛋白融合，再根据蛋白质之间的接近程度，将邻近的蛋白质生物素化，从而筛选蛋白质有相互作用的蛋白。野生型BirA催化两步反应：首先，从生物素和ATP生成反应性生物素-AMP。其次，将生物素-AMP连接到乙酰辅酶A羧化酶的特定赖氨酸上。
BioID有其自身的内在优势和局限性。 BioID融合蛋白在一段时间内在自然细胞环境中标记相邻蛋白。 所有的蛋白质都被变性和溶解，只有那些被生物素化的蛋白质才被选择性地捕获。对比CO-IP而言，CO-IP只可以捕获稳定结合的蛋白，也就是说蛋白结合力要够强才能够被拉下来，这样一些作用时间短的蛋白或者是作用力弱的结合就不会拉下来，造成假阴性结果。更重要的是，对于我们一些感兴趣的区域，比如突触间隙和线粒体IMS，是不能纯化的，因此也不能进行下一步的质谱分析。BioID的作用机制还允许鉴定瞬时的相互作用。BioID的局限性包括需要表达外源融合蛋白，尽管该蛋白的水平不需要很高。生物素连接酶的加入可能会损害正常的靶向，稳定性或功能，同时如果候选的蛋白质缺乏可接触的伯胺用于生物素化，可能会出现假阴性。
利用BioID探究蛋白之间的相互作用，需要在目的基因中加入BirA2基因使其在表达目的蛋白的同时表达BirA2。NMDA受体是跨膜蛋白，其氨基端在膜外，C terminus 与下游信号通路相关，因此将BirA2插入至GluN2A/GluN2B的C端。此外，由于GluN2A/GluN2B通过C terminus的PDZ domain与PSD95结合参与下游信号通路， 且其只有3个氨基酸组成，为了避免插入较大的BirA2影响PDZ的正常功能，结合文献，在GluN2A基因距离C端168个氨基酸处插入BirA2基因，在GluN2B基因距离C端169个氨基酸处插入BirA2基因。
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