抗肿瘤格尔登素的基因工程结构改造
实验背景
格尔登素是链霉菌产生的安莎类抗生素，具有抗肿瘤活性。格尔登素可以与在肿瘤细胞中高表达的热休克蛋白Hsp90的ATP结合位点结合，抑制其生物学功能，最终导致细胞的生长抑制甚至死亡。目前，一些格尔登素的结构类似物如17-AAG和17-DMAG已经进入了临床研究阶段，但它们仍然存在口服生物利用度低、水溶性差等问题，在临床实验中也发现这些化合物有肝脏毒性，因此亟需开发效果更好、毒性更低的格尔登素衍生物。
研究表明，格尔登素的生物活性可能与其构象有关。格尔登素有顺式和反式两种构象，和Hsp90蛋白结合时为顺式酰胺，在溶液中则主要为反式酰胺，只有当酰胺由反式变为顺式之后才可以与Hsp90作用。有研究用靶向分子动力学方法模拟了这两种构象之间的转换过程，大致分为三步：苯醌环先发生折叠， 同时10-15位和2-6位的碳键构象发生变化，这时形成的酰胺键仍然是反式的。然后酰胺键构象由反式变为顺式，同时11-15位的碳向双键部分移动。最后C11羟基和C12甲氧基的构象发生变化。对格尔登素构象转换过程中产生的中间结构进行能量测定，发现与蛋白结合的顺式构象稳定性更差，能量更高，由反式转化为顺式这个过程熵是减少的。
在与Hsp90结合时，格尔登素折叠成一种紧密的C型构象。苯醌结构和Hsp90结合口袋的入口处结合，安莎环则插入口袋之中。折叠后的格尔登素可以和Hsp90的氨基酸侧链基团形成范德华力和氢键等相互作用，其中最重要的是7位氨甲酰基与天冬氨酸侧链形成的氢键。氨甲酰基上的氨基氢与天冬氨酸的氧原子形成氢键，而羰基氧通过水分子与天冬氨酸间接形成氢键。研究发现，如果移除氨甲酰基或者对氨甲酰基进行修饰，格尔登素会完全失活。
格尔登素是一种I型聚酮类化合物，它的生物合成过程包括以3-氨基-5-羟基-苯甲酸为起始单元的I型聚酮合成，以丙二酸、2-甲基丙二酸和2-甲氧基丙二酸为延伸单元的聚酮链延伸以及四步的后修饰反应。它的生物合成基因簇和具体功能已经被鉴定出来：gdmA1、gdmA2、gdmA3负责PKS的合成，一共包含7个合成单元。gdmH、gdmI、gdmJ、gdmK、gdmG负责PKS上glycolate单元的合成，gdmL、gdmM、gdmN、gdmP负责后修饰步骤，gdmO则与AHBA的合成有关。
实验目的
- 失活KR4和KR6基因
分别将格尔登素PKS基因簇中的酮基还原酶KR4和KR6失活，则5位和9位的羰基无法被还原，在最终产物中表现为4-5位和8-9位的碳碳双键变为羰基。推测羰基会和7位酰胺发生亲核反应成环，形成刚性结构，利于格尔登素形成能和蛋白结合的顺式构象，提高格尔登素的生物活性。
- 过表达asm10和asm25基因
asm10基因是从安丝菌素生物合成基因簇中分离得到的，研究发现它编码的蛋白是一种甲基转移酶，在安丝菌素的后修饰过程中负责酰胺氮的甲基化。asm25基因编码一种糖基转移酶，可以将UDP-glc的糖基转移到酰胺氮上。在链霉菌Streptomyces hygroscopicus XM201中分别表达asm10和asm25基因，推测可以产生酰胺氮上甲基化和糖基化的格尔登素，提高格尔登素的水溶性和生物活性。
实验方案
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