一种新型CETP抑制剂3E-TP對豚鼠高脂血症的影响文献综述

[研究背景]

高脂血症是由于全身脂肪代谢紊乱引起血浆中一种或几种脂质结构失衡的疾病。其诊断标准与血总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)和血清中甘油三酯(TG)有关。随着我国经济的迅速发展及人们生活水平的不断提高,心脑血管疾患日益增多,其中高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素。胆固醇酯转移蛋白(CETP)在脂蛋白之间转运中性脂肪,导致胆固醇酯从高密度脂蛋白(HDL)向极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)的净迁移。CETP在血浆HDL代谢中发挥着非常重要的作用，因此，CETP抑制剂有可能成为预防和治疗心血管疾病的一种新型药物。CETP抑制剂的临床研究也证实了这一点。

[研究意义]

1. 通过实验筛选出药效更好的治疗药物
2. 对高脂血症的治疗具有一定意义

[研究目的]

1. 考察阳性药和受试化合物对正常豚鼠血脂水平的影响
2. 探讨CETP抑制剂对高脂血症的影响

[研究主要内容、步骤、方法及措施]

实验材料

1. 实验动物

雄性Hartley豚鼠，普通级，3-4周龄，体重230g~250g。豚鼠饲养条件：室内风扇通风换气，室温21-23^oC，湿度40-60%，明暗周期12小时(7am-7pm)，饲养于标准鼠笼中，鼠笼、饮水瓶均经过消毒处理，实验动物自由饮水、定量摄食。

2. 饲料

常规饲料，饲料配方营养成分见表1：

表1豚鼠各组饲料配方及营养成分（g/100g）

Tab.1 Composition of experimental diets for studies (g/100g)

注：矿物质和维生素含量符合豚鼠的NRC营养标准

Mineral and vitamin mix adjusted to meet NRC requirements for guinea pigs

3. 试剂及配置

胆固醇，猪油

血清甘油三醋(TG)，批号：080331、血清总胆固醇(TC)，批号：090411、血清直接低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，批号：090221、血清直接高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，批号：090291，均为中生北控生物科技股份有限公司产品。

豚鼠胆固醇醋转移蛋白(CETP)，批号：301330221202，为上海朗顿生物科技有限公司(ADL)。

4. 主要仪器设备

全自动生化分析仪(7060)：日本日立公司

组织匀浆机(F6/10)：FLUKO

自动酶标洗板机(DEM系列)：北京拓普分析仪器责任有限公司

微孔板扫描分光光度计(MQxZoo)：美国Blo-TEK

低温离心机(Labofuge400R)：北京五洲东方科技发展有限公司

漩涡混合器(VDRTEX-5)：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司

5、实验方法

（1） 动物分组及给药

上述动物（40只）适应性饲养3天后，将豚鼠随机分为正常组(Control)、阳性对照组(Positive control)和两个受试组(Test A和Test B)，每组10只。正常对照组、阳性对照组和受试组均喂养常规饲料(见表1)，自由饮水。

正常组(Control)：10只豚鼠，每日定量加入饲料并记录消耗量，喂养1周。

阳性对照组(Positive control)：10只豚鼠，每日定量加入饲料并记录消耗量，同时，口服给药Anacetrapib （溶解在DMSO/cremophor/saline = 3:4:93），15 mg/kg剂量，每日1次，连续1周。

受试组A (Test A)：10只豚鼠，每日定量加入饲料并记录消耗量，同时，口服给药化合物CDY-1（溶解在DMSO/cremophor/saline = 3:4:93），30 mg/kg剂量，每日1次，连续1周。

受试组B (Test B)：10只豚鼠，每日定量加入饲料并记录消耗量，同时，口服给药化合物CDY-2（溶解在DMSO/cremophor/saline = 3:4:93），30 mg/kg剂量，每日1次，连续1周。

处理过程：末次喂养后禁食不禁水6小时后处理所有动物。眼眶取血，离心分离血清，用于血清TC、TG、LDL-C、VLDL-C、HDL-C和CETP含量测定。

（2） 观察和检测指标

血清脂质测定：血浆以3000r/min，4^oC离心10分钟后分离血清，分装，-20℃冻存。参照试剂盒说明书于全自动生化分析仪上测定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C含量，TC采用CHOD-PAP法，TG采用GPO-PAP法，LDL-C、VLDL-C和HDL-C采用直接酶法测定。

酶联免疫吸附法测定血清CETP：利用ELISA试剂盒对豚鼠和大鼠血清中的CETP的蛋白表达进行测定。所用剂盒中的抗体为羊抗豚鼠单克隆抗体。实验原理为：纯化的抗体包被于微孔板制成固相抗体，在微孔中加入豚鼠的血清样品后，被包被的单抗可与其特异性结合，然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素形成酶一抗原抗体复合物，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，再加酸性终止液提高敏感性,溶液最后呈黄色，颜色的深浅和样品中的相应抗体水平呈负相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，最后通过绘制Log-logit双对数标准曲线计算样品浓度。具体操作步骤如下：

1. 实验前准备：将试剂盒取出室温静置30 min以上，配置洗液(1:20稀释)。

2. 加样：将100林L标准品和待测样品加入己包被相应抗体的各反应孔中，然后加入50 uL酶标记溶液，轻轻混匀30s，封住孔板，37℃孵育l h。

3. 洗板：甩净板内液体，在洗板机上用洗液洗涤5次(每孔加样350 uL洗涤液)，

除去残余洗液，用滤纸控干。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液，轻轻混匀10s，37^oC避光孵育15 min，溶液呈蓝色。

5. 终止反应：于各孔加入1M盐酸5 uL，溶液变为黄色。

6. 结果判定：于酶标仪450 nm处，空白对照孔调零后测定标准孔及待测孔OD值，绘制Log-logit双对数标准曲线并计算样品浓度。在酶联免疫反应中，0时结合率为100%，在某一浓度下的结合率为B(B = OD/ODo)，各标准点或样品的logit值计算公式为logit=In[B/(1-B)]。以标准浓度取log值为横坐标，相对应的logit值为纵坐标绘制标准曲线，根据待测样品的logit值计算样品的浓度值。

血压测定：采用血压仪测，生物技能实验系统。

[文献综述]

胰岛再生的相关研究

摘要：随着近年来糖尿病发病率不断上升，这种疾病的发病现状以及治疗方法开始引起人们的注意。糖尿病的治疗与胰岛beta;细胞密切相关，本文对糖尿病及胰岛细胞的再生方面的进行综述，并对其研究手段斑马鱼模型作出简介。

关键词：糖尿病；胰岛细胞；斑马鱼模型

1.糖尿病的相关介绍

1.1 糖尿病的发病现状

糖尿病(Diabeetsmelliuts,nM)发病机制复杂,涉及遗传、环境、免疫调控和化学因子等多种因素。近年来,糖尿病的发病率不断上升。据2000年第17届国际糖尿病大会调查结果显示,全世界糖尿病患者数已超过1.5亿(我国也已达4000万) ^[[1]]。预计到2030年全球糖尿病患者将超过五亿人，将成为全球最常见的慢性疾病^[[2]]。

1.2糖尿病的分类

具有一系列代谢性疾病的特征，由于胰岛beta;细胞分泌的胰岛素不足而导致血糖升高，伴有或不伴有胰岛素抵抗，且是与自身免疫相关的一种疾病。根据其病因学，糖尿病可以分为: 1型糖尿病(T1DM) ; 2 型糖尿病(T2DM) ;妊娠期糖尿病和特殊类型糖尿病等。其中2型糖尿病和1型糖尿病为最主要的发病形式^[[3]]。

1.3糖尿病的治疗现状

I型糖尿病,即胰岛素依赖型糖尿病(mDM)的发病多在青少年时期,发病时体内胰岛迅速破坏,胰岛素严重不足,必须长期依赖外源性胰岛素治疗,但长期使用胰岛素会产生诸如失明、肥胖、肾衰等严重的并发症,并且患者必须每天注射胰岛素、监测体内血糖水平以便调整胰岛素用量,使得医、患双方都颇感痛苦[^[4]]。目前1型糖尿病的治愈方法是胰腺或胰岛移植，前者手术风险较大，并发症发生率高，后者虽简单安全但却需要2-3个以上供体的胰岛才能达到治愈的目标。供体的严重短缺限制了这一技术的广泛应用^[[5]]。

2型糖尿病(T2DM)患者beta;细胞功能和数量进行性减低。患者在诊断为糖尿病时,其胰岛功能大约只有正常的二分之一,尸检结果显示beta;细胞数量大约减少了60%^[[6]]。目前，2型糖尿病的治疗方式，主要是体内注射胰岛素或服用一些刺激胰岛素分泌的药物，使患者的血糖控制在正常水平。胰岛移植能够使糖尿病患者体内的血糖恢复到正常水平，而且能够防止或逆转糖尿病的微血管病变，但胰岛捐献的数量根本无法满足越来越大的需求^[[7]]。

2.胰岛细胞的再生

胰腺细胞由来源于内胚层的内分泌细胞和外分泌细胞两种主要细胞类型组成。胰外分泌腺占胰腺的大部分，主要负责合成消化酶及其运输。内分泌腺只占胰腺不到2%，由alpha;、beta;、delta;、ε 和PP 细胞组成的胰岛是胰腺的功能单位，产生胰岛素的beta; 细胞在葡萄糖动态平衡中发挥核心调控作用。因此，绝对或相对的beta; 细胞的缺乏可能最终分别导致Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。所以糖尿病研究的一个主要目标就是了解胰腺beta; 细胞发育过程中的分子机制，也包括成人胰腺损伤的再生机制^[[8]]。

2.1生长因子及细胞

2.1.1 Betacellulin

Betacellulin(BTC,又译beta;细胞素,beta;细胞调节素)是近年来逐渐受到关注的一个胰岛再生相关因子。

BTC对链脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶、部分胰腺切除诱导糖尿病大鼠模型均有促进胰岛再生的作用。主要表现为beta;细胞数量增多,胰腺内胰岛素含量增加,出现ICCs,糖尿病动物血糖下降,糖耐量得到改善等。实验显示,BTC不仅刺激胰腺beta;细胞增殖,还促进导管来源的beta;细胞前体细胞的增殖及向beta;细胞分化,形成ICCs。

BTC主要是通过促增殖(胰岛细胞、干细胞)、促分化(胰岛内干细胞、导管干细胞、其他器官内的干细胞等)这两种途径来实现beta;细胞再生^[[9]]。

2.1.2骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）来源广泛，取材方便，具有多项分化潜能，可避免免疫排斥反应，并能够分泌SDF-1、VEGF等与促进血管形成、修复受损组织相关的细胞因子。研究表明将同基因型或同种异基因型的MSCs移植入链脲菌素（Streptozotocin，STZ）制成的糖尿病鼠体内，可以明显降低血糖，延长生存时间。

其可能机制为：1.MSCs 通过启动SDF-1/CXCR4 轴动员了具有干细胞潜能的胰腺导管上皮细胞增殖进而促进残存胰岛再生、修复。2.MSCs 可能通过 SDF-1/CXCR4 轴促进了残存胰岛周围新生血管的形成，为受损胰岛的再生提供了良好的微环境^[[10]]。

2.1.3 ES 细胞

ES 细胞是从着床前的早期胚胎( 囊胚) 内细胞团中分离得到的一种干细胞, 理论上具有发育和分化成为机体内几乎所有组织细胞类型的潜能。

在ES 细胞培养体系中使用不同的培养基和细胞外基质或者添加不同的生物因子来改变其生长条件, 采取分阶段诱导的方式, 可将ES 细胞定向分化为胰岛样细胞。但目前有关诱导hES 细胞定向分化为胰岛素分泌细胞的研究距离临床应用尚有一定距离。首先, 这些分化方案本身面临着以下技术瓶颈: 诱导分化效率低且不稳定; 分化方案并非适合所有的ES 细胞系; 分化细胞的成熟度低, 大多属于胰腺前体细胞或相当于胎儿胰岛细胞, 需要进一步诱导成熟。其次, hES 细胞研究面临着许多难题和争议: hES 细胞建系效率低, 且必须摧毁人类早期胚胎; 移植到体内后有发展为肿瘤的潜在风险。最后, 对于应用研究而言, 更为重要的问题是患者对hES 细胞分化而来的各种细胞和组织存在免疫排斥反应^[[11]]。

2.2 药物

2.2.1噻唑烷二酮类药物(TZDs)

TZDs可以有效降低T2DM患者的血糖,并对beta;细胞具有显著的保护效应,已被广泛应用于临床。

TZDs对胰腺beta;细胞的作用机制可分为间接作用和直接作用。一方面,TZDs可以降低糖脂毒性,减少TNFalpha;,增加脂联素,从而间接影响beta;细胞,促进其增殖和肥大,抑制其凋亡,增加葡萄糖摄取,减轻胰岛素抵抗;另一方面,TZDs通过过氧化物酶体增殖物激活受体gamma;(PPARgamma;)发挥直接作用,减少胰岛素原,增加胰岛素合成与分泌。TZDs无论是单药治疗还是联合治疗T2DM,均可增加胰岛素敏感性,并通过减轻胰腺负荷来保护beta;细胞。

2.2.2肠促胰岛素类似物

临床前研究已证实,GLP-1和GIP能够保护朗格汉氏胰岛细胞,并促进其增殖。但只有前者及其类似物可以用来治疗糖尿病。一方面因为GLP-1受体表达广泛,且GLP-1与诱导beta;细胞增殖、提高细胞存活相关,从而引起人们的兴趣,应用其治疗T2DM。另一方面,现已证实,T2DM患者体内GLP-1水平降低,但GIP水平正常,这提示T2DM患者对GIP的生物效应产生抵抗。换言之,GIP相对失效了^[[12]]。艾塞那肽利和拉鲁肽是2个已上市的胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)类似物，GLP-1的降糖作用主要通过促进胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌两个方面来实现的。GLP-1可以作用于beta;细胞促进胰岛素基因转录，胰岛素合成和分泌，刺激beta;细胞增生和分化，抑制其凋亡^[[13]]。

2.2.3 二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase,DPP-4）抑制剂

作为新型口服降糖药,DPP-4可快速灭活GLP-1,抑制DPP-4酶活性,可增强内源性GLP-1在体内的作用。但有研究发现,实验组给予T2DM患者DPP-4抑制剂,与服用安慰剂的对照组相比,实验组餐后活性GLP-1浓度增加1倍,血糖控制情况得到改善;但外源性注射GLP-1,使其增加到相同浓度,并不能改善胰岛素分泌和血糖水平。因此,DPP-4抑制剂治疗糖尿病也可能是通过抑制一些生物活性多肽来发挥作用,而并非通过GLP-1^[[14]]。

2.3 胰岛移植

胰岛移植手术相对安全简便,可减少外源性胰岛素的用量,防止糖尿病并发症的发生与进展,提高患者生活质量,有望成为糖尿病的最终治愈方案。人同种异体胰岛移植是目前公认的有效治疗手段,但供体不足严重阻碍了胰岛移植的发展。解决供体来源不足的可能途径包括诱导干细胞分化为胰岛细胞。有研究表明胚胎干细胞、成体胰腺干细胞或胰腺前体细胞、MSC等均可诱导分化为胰岛素阳性细胞。然而,这些细胞并非真正的beta;细胞,不能完全具有正常beta;细胞的功能。一些分化细胞尽管可以分泌胰岛素,但只能表达少量的胰岛素,且不能对葡萄糖等正常促分泌刺激有适当的反应。因此,仍需进一步研究,使体外诱导再生的beta;细胞能够满足移植的要求,从而解决供体短缺的问题。

能够大量产生胰岛素的几个潜在来源为数目剧增的糖尿病患者所需要的“胰岛移植”提供了更多选择。这些来源包括以下内容:①在体内或体外自身beta; 细胞自我复制; ②其他供体胰岛细胞增殖; ③导管细胞内源性祖细胞( 胚胎导管上皮细胞) 或成人导管上皮细胞分化; ④诱导胚胎干细胞 ( ESCs) 分化;⑤腺泡、肝和肠内分泌细胞等相关类型细胞转分化。

2.4 其他胰岛细胞再生方法

2.4.1 beta;细胞的自我增殖

胰腺部分切除后beta;细胞的增殖是胰岛beta;细胞再生的重要方式之一。胰岛beta;细胞的再生在生理和病理状态下对机体胰岛素的分泌都起着重要的代偿作用。胰腺部分切除手术虽然能在短时间内造成胰岛细胞大量减少，破坏血糖水平的稳定，但机体内的胰岛beta;细胞会出现代偿性再生，用于弥补胰岛素分泌的不足。

胰腺部分切除后beta;细胞的增殖可能与表皮生长因子 (Epidermai Growth Factor,EGF)、胃泌素（gastrin）、胆囊收缩素( Cholecystokinin CKK) 和神经元素3(Neuorgenin,Ngn3) 等蛋白因子相关^[[15]][[16]]。

2.4.2减肥手术后患者的胰岛细胞再生

Service等对6 例胃旁路手术后出现餐后神经低血糖症症状的患者进行观察性研究, 每位患者均行胰腺部分切除术, 以控制严重低血糖, 术后胰腺组织学检查均发现胰岛细胞增生症, 其中1 例甚至还出现了多发性胰岛素瘤。免疫组织化学染色可见5 名患者在胰腺导管中出现胰岛素阳性细胞。上述结果提示, 胃旁路手术可促进胰岛细胞增殖和( 或) 新生。其机制可能与GLP- 1 分泌增加和胰岛素抵抗减轻有关^[[17]]。

3.斑马鱼模型

3.1 斑马鱼的优点

斑马鱼成鱼体型较小，体长4~6厘米，胚胎透明且体外发育，易于活体观察；生长发育快，受精后 2 4 小时主要器官原基基本形成，便于研究组织器官的发育和功能；2~3个月可长成成鱼，繁殖能力强且易于饲养，雌鱼每周可产卵200~300枚，可快速获得大量胚胎。斑马鱼的特点使其在20世纪70年代开始受到科学家们的关注，并成为最重要的模式脊椎动物之一。随着斑马鱼基因组测序工程的完成，发现斑马鱼的基因与人类的基因保守度达到 85%，使得斑马鱼成为一种研究人类疾病的模式动物越来越受到人们的关注^[[18]]。

3.2 斑马鱼研究的发展

斑马鱼(Danio rerio)已经成为一种理想的脊椎动物模式生物。最初, 斑马鱼被认为是一种监测水体污染物的动物模型, 用于检测致畸性和有毒物质。1981 年, Streisinger 等在 Nature 上发表了开创性的斑马鱼纯合二倍体的工作, 首次将斑马鱼引入遗传和发育生物学领域^[[19]]。1994 年, 以“斑马鱼发育和遗传”为主题的国际会议在美国冷泉港实验室召开。Nature和 Science 杂志均为此发表了相关的专题评述, 标志着以 George Streisinger 发表的斑马鱼开拓性工作为起始, 斑马鱼作为新的脊椎动物模型为学术界所接受。我国 20 世纪 90 年代后期开始组建研究斑马鱼的实验室。短短十几年, 斑马鱼俨然已成为生物医学领域研究的明星和热点, 越来越多的科学家已认识到斑马鱼作为独特研究遗传和发育生物学及人类疾病机理和治疗的理想脊椎动物模型的优越性和重要性^[[20]]。

3.3 斑马鱼在研究中的应用

3.3.1 癌症

斑马鱼能像人类一样患癌症且具有稳定遗传性，遗传背景相对简单，其体内的致癌基因、肿瘤抑制子等与肿瘤相关基因也与人类有高度的保守性。通过诱变基因或细胞移植的方法可使斑马鱼体内产生或移入具有高度转移性的肿瘤细胞，并使斑马鱼罹患癌症，且患有癌症的斑马鱼与同类正常鱼杂交产生的后代也具有癌症的表型。目前，已经建立了白血病、黑色素瘤、横纹肌肉瘤，淋巴肉瘤，肝癌，乳腺癌等疾病的斑马鱼模型，斑马鱼体内和人体内的肿瘤在组织学上的相似性使得这些肿瘤模型在其相应人类疾病的研究中有着重要的意义^[[21]]。

3.3.2造血系统的调控机制

脊椎动物的造血过程是一个连续动态的过程, 大致分为初级造血和次级造血, 在该过程中存在许多关键的调节因子如 SCL、LMO2、GATA1、GATA2 等等, 这些调节因子与相应的信号通路之间相互作用, 形成复杂的网络, 精确调控细胞的运动、增殖、凋亡及分化, 从而调控整个造血过程。由于越来越多的血液疾病正在威胁着人类健康, 因此利用斑马鱼作为模式动物探究造血作用的机制, 进而指导临床治疗, 已经成为当今的研究热点之一^[[22]]。