姓名

贾梦凡

学号

2020170246

专业

食品质量与安全

指导教师

綦国红

课题名称

低聚果糖对植物乳杆菌生长、耐受和黏附能力的影响

课题性质

基础研究 radic; 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

一、课题背景

低聚果糖又称寡果糖或蔗糖三糖族低聚糖。低聚果糖通常在食用的很多水果、蔬菜中均存在。低聚果糖拥有保健功能确切和食品配料优良的双重品格并以其低热值、无龋齿、促进双歧杆菌增殖、降血糖、改善血清脂质和促进微量元素吸收等优良生理功能而被广泛研究。

植物乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，属于同型发酵乳酸菌，常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用，可抑制病原菌生长、调节肠道微生态、降低血清胆固醇等。

植物乳杆菌在肠黏膜的黏附是其在机体内定植并产生生物屏障作用的第一步，具有抑制病原菌入侵和增殖等重要生理功能，因此黏附能力是评价植物乳杆菌定植形成稳定的菌群发挥益生作用的重要指标之一。黏附能力又与菌株的凝集能力和表面疏水性有关。表面疏水性是通过测定菌体细胞表面的物化性质来间接反映其黏附性强弱的。菌株的凝集包括自凝集和与致病菌的共凝集，分别指同一菌株之间的凝集现象及不同菌株之间的凝集现象。研究证明，具有较强凝集能力的菌株可能具有更强的肠道定殖能力和抑制病原菌的能力。

通过资料查阅，可以得知，低聚果糖作为益生元对植物乳杆菌的生长具有一定的促进作用，而本实验旨在利用现代化的研究手段进一步探索低聚果糖对植物乳杆菌的耐受性和黏附能力的影响。

1. 要解决的问题
2. 培养基的选择。
3. 确定低聚果糖添加的浓度范围。
4. 低聚果糖对植物乳杆菌生长情况的影响。
5. 低聚果糖对植物乳杆菌黏附能力的影响。
6. 低聚果糖对植物乳杆菌耐受能力的影响。
7. 可行性分析
8. 文献的支撑，已经有益生元对于植物乳杆菌相关的实验作为基础。
9. 低聚果糖自身具有的促进体内有益菌的代谢和增殖的特性。
10. 植物乳杆菌对培养环境的要求相对较低。
11. 研究方法和内容

4.1菌液的配置

植物乳杆菌：将-80℃冷冻保存的植物乳杆菌种接种于MRS液体培养基中，37 ℃静置培养48h，待培养基浑浊后取2%的菌液接种于MRS液体培养基中，37 ℃ 静置培养 24 h，即种子液，剩余液体用甘油管保藏。

大肠杆菌：将-80 ℃冷冻保存的大肠杆菌菌种接种于LB培养基中，37 ℃静置培养24h，待形成菌落后挑取单个菌落接种于营养肉汤液体培养基，置于摇床中37℃，120r/min培养24h，即得种子液。

4.2低聚果糖对植物乳杆菌生长曲线的影响

在MRS液体培养基中分别接种2%的植物乳杆菌种子液，静置培养48 h，测定其600nm下的OD值。以培养时间为横坐标，对应点的OD值为纵坐标，绘制出各组植物乳杆菌的生长曲线。以葡萄糖培养基组作为对照组，对比添加不同浓度低聚果糖对植物乳杆菌生长曲线的影响。

4.3低聚果糖对植物乳杆菌凝集能力的影响

4.3.1 低聚果糖对植物乳杆菌自凝集能力的影响

在MRS液体培养基中分别接种2%的植物乳杆菌种子液，静置培养 24 h。以5000 r /min的速度离心10 min后收集菌体，使用pH为7.2的PBS洗涤2次后于PBS中重悬，调整菌数为108 cfu/mL。取 5mL等量的细胞菌悬液装入离心管中，混匀后在室温下静置。在 0、2、4、6 和 8 h 分别取0.5 mL上部菌悬液，加到1.5 mL的PBS 中，混匀后测定该菌悬液在600 nm下的吸光值，以PBS缓冲液为空白对照。凝集率的计算公式如下:

自凝集率( % ) =（A₀-A_t）/A₀*100

式中: A₀为0h测定的600nm下的吸光光度值;

A_t 为不同时间在600nm的吸光光度值。

4.3.2 与大肠杆菌共聚集能力的影响

大肠杆菌悬液的制备同4.3.1中植物乳杆菌采用同样的方法，重悬于PBS中，调整菌数为 108 cfu /mL。分别吸3mL植物乳杆菌悬液和大肠杆菌悬液于试管中，漩涡混合30 s，分别于 0、2、4、6、8 h 吸取上部悬液测定其在600 nm下的吸光值。对大肠杆菌的凝集率计算公式如下:

植物乳杆菌与大肠杆菌共凝集率( % ) = （A₀-A_t）/A₀*100

式中: A₀为 植物乳杆菌和大肠杆菌混合0h时在600nm下测定的吸光光度值;

A_t为混合液在不同时间的吸光光度值。

4.4低聚果糖对植物乳杆菌表面疏水能力的影响

表面疏水性能力的测定采用微生物黏附碳氢化合物法( Bacteria Adhesion To Hydrocarbons，BATH)。植物乳杆菌悬液的制备同4.3.1分别吸取6mL植物乳杆菌悬液与1 mL二甲苯涡旋混合60 s,停顿 10s，再涡旋混合60 s，室温下静置 60 min分层。取下层水相，测定其在600 nm下的吸光值,以PBS缓冲液为空白对照。表面疏水率计算公式如下:

植物乳杆菌表面疏水率( % ) = (H₀-H₁)/H₀*100

式中:H₀为与二甲苯混合前600 nm下的吸光光度值;

H₁为与二甲苯混合后600 nm的吸光光度值。

4.5低聚果糖对植物乳杆菌耐受的影响

4.5.1低聚果糖对植物乳杆菌耐酸性的影响

将2%的植物乳杆菌种子液接入pH为2、3、4的MRS液体培养基中。在37℃下培养24h，测定其在600nm处的吸光度值。以不接入种子液的MRS培养基作为空白对照，以OD₆₀₀值来评价菌株的耐酸能力。以加入葡萄糖作为碳源的正常MRS培养基作为对照组，来观察加入低聚果糖作为碳源的MRS培养基中植物乳杆菌的生长情况。

菌株生长效率（%）=[（A₃-A₀）/(A₄-A₁)]*100

式中：A₃表示静置24h，pH为2、3、4MRS培养菌液的OD₆₀₀值；

A₀表示静置24h，pH为2、3、4MRS培养基的OD₆₀₀值；

A₄表示静置24h，正常MRS培养菌液的OD₆₀₀值；

A₁表示静置24h，正常MRS培养基的OD₆₀₀值。

4.5.2低聚果糖对植物乳杆菌耐盐程度的影响

将2%的植物乳杆菌种子液接入分别含有4%、8%、12%、16%NaCl的MRS液体培养基中。在37℃下培养24h，测定其在600nm处的吸光度值。以不接入种子液的MRS培养基作为空白对照，以OD₆₀₀值来评价菌株的耐盐能力。以加入葡萄糖作为碳源的正常MRS培养基作为对照组，来观察加入低聚果糖作为碳源的MRS培养基中植物乳杆菌的生长情况。

菌株生长效率（%）=[（A₃-A₀）/(A₄-A₁)]*100

式中：A₃表示静置24h，加入NaCl后MRS培养菌液的OD₆₀₀值；

A₀表示静置24h，加入NaCl后MRS培养基的OD₆₀₀值；

A₄表示静置24h，正常MRS培养菌液的OD₆₀₀值；

A₁表示静置24h，正常MRS培养基的OD₆₀₀值。

1. 工作计划

2月28日—3月17日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。

3月18日—5月20日：完成实验任务的全部工作。

5月20日—5月26日：完成毕业论文的撰写工作。

5月26日—5月28日：完成毕业论文的评阅与修改工作。

5月28日—答辩前：完成毕业论文的校对等工作。

[参考文献]

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学生签名：贾梦凡 2021 年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 2021 年 月 日

所在教研室审查意见：

负责人签名： 2021 年 月 日