开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)
课题背景:
二羟基丙酮,全名为1,3-二羟基丙酮,英文名为1,3-Dihydroxyacetone,简称DHA,是一种天然的、最简单的多羟基酮糖,带有甜味,易溶于水和乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂[1],对人体和环境无毒无害,可以食用,并且可以降解[2],熔点为75-80℃,在20℃时,水溶性gt;250g/L,在 pH 6.0 时稳定[3],正常情况下以二聚体结晶的形式存在,在经过加热或溶解后,变成单体,在水溶液中两种形式相互转化,但在乙醇溶液中,DHA以二聚体形式存在[4]。DHA是单糖中的非还原性糖,并且无不对称碳原子,没有旋光性,化学性质活泼,广泛参与聚合和缩合等反应,用途广泛并且需求量大,是一种重要的医药中间体、食品添加剂、化妆品添加剂以及化工原料,同时还能作为抗毒试剂应用于食品保鲜,DHA 还有许多其它的用途正在积极的研究和开发之中[5-6]。它目前的生产方法主要有化学合成和微生物发酵两种,其中化学合成为主要方法[7-8]。微生物法生产DHA较之化学法生产有原料利用率高、副产物少、反应条件温和、产品纯度高及工艺简单和易于控制等优点,从长远角度看,微生物发酵法在社会环境和经济效益上都比化学合成法更有优势[9]。在上世纪60~70年代,国外就已经形成了用甘油为底物、工业化微生物发酵生产DHA的方法,目前,国外已实现了大规模工业化微生物发酵法生产DHA;虽然国内在发酵法生产DHA菌株筛选和工艺优化方面也取得了很大进展,但与国外相比,还存在一定的差距[10-11]。
微生物发酵生产DHA的机理是微生物代谢活动中产生的甘油脱氢酶, 在甘油脱氢酶的作用下,甘油分子结构中2位C上的羟基发生脱氢反应, 生成二羟基丙酮。根据相关文献的报导资料,符合发酵要求的微生物有醋酸杆菌、毕赤酵母和大肠杆菌等,其中利用醋酸杆菌发酵的最多,通过该细菌生长细胞在完全培养基中批次发酵并转化甘油生成DHA,发酵时间为60h至80h,生成的DHA浓度可达60g/L[12]。
常用的二羟基丙酮分析方法有显色法、薄层色谱、纸层析、气相色谱、高效液相色谱等方法,其中用薄层色谱分析法对DHA准确定量困难,并且所用试剂昂贵,另外由于DHA的挥发性不高,需要先将其衍生化为易挥发且稳定性高的衍生物才能间接测定含量。气相色谱分析法(GC)衍生化过程复杂,测定时需要的衍生化试剂较多,高效液相色谱法要求样品进样量大,需要的仪器昂贵,检测不便。DHA可以与二苯胺、DNS等物质发生反应,生成有颜色的物质,其颜色的深浅与DHA的含量成正相关,利用这一原理,可以在反应完成后,用分光度计检测DHA的含量,并且二苯胺显色法简单、快捷,特别适合于菌株选育过程中大量样品测定。
影响微生物发酵的因素有碳源、氮源、无机盐、生长因子、发酵温度及pH、通气量等,本实验主要探究碳源、氮源和无机盐对发酵的影响。首先用控制变量法探究在二经基丙酮高产菌株发酵过程中,单因素对发酵过程的影响,然后在单因素结果的分析上,再应用响应面方法对二羟基丙酮菌株发酵培养基成分及发酵培养条件进一步优化,获得高产菌株最佳的培养基与发酵工艺参数,提高菌株发酵产二羟基丙酮的生产性能。
实验流程:
- 培养基的配置
种子培养基(g/L):葡萄糖20,酵母膏5,甘油20;
发酵培养基(g/L):甘油120,酵母膏5,消泡剂0.1;
斜面培养基(g/L):葡萄糖20,酵母膏5,甘油20,琼脂粉10,碳酸钙 5;
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