一、研究背景
乳腺癌是常发于女性之中，据统计全球每年新增乳腺癌患者在200万左右，每年死亡数60万，而在我国乳腺癌发生率已经排在女性肿瘤第一位，且发病率与死亡率仍在持续上升，有关研究表明乳腺癌的发生可能与雌激素的过量产生有关。
雌激素主要由雌二醇、孕酮和雌三醇三种物质组成，在生理上雌激素有利于女性的生殖活动，能够促进子宫内膜的发育同时还能够抑制骨骼分裂防止骨质疏松。雌激素导致乳腺癌产生的原因可能有：1.雌激素本身或通过与雌激素受体结合形成的信号转导通路能够促进乳腺细胞大量增生；2.雌激素的代谢产物4-羟基儿茶酚雌激素（4-OHE）具有一定的致癌效应，该物质能与DNA共价结合，导致脱嘌呤现象，以此诱导肿瘤产生[1]。另外，一些其他领域的研究发现，雌激素可能引起乙型肝炎硬化[2]；颅内动脉瘤的发生也可能是由于雌激素的缺乏造成的[3]。
近年来，CRISPR/Cas系统被广泛应用于基因筛选技术上，相比于传统的cDNA，RNA干扰筛选文库，CRISPR系统具有其独有的优势，如既能进行功能缺失型筛选又能进行功能获得型筛选；脱靶率较低；能够对非编码DNA功能元件进行筛选[4]。CRISPR筛选文库包括三种：敲除文库，抑制文库和活化文库[5]。敲除文库是利用Cas9蛋白靶向切割DNA特殊位点，以实现基因敲除；抑制文库和敲除文库类似，也是抑制相关基因表达，但抑制文库并不切割DNA，而是通过dCas9蛋白质融合体募集抑制因子或形成异染色质以阻碍基因表达[5]。活化文库与前二者不同，它主要是通过dCas9融合蛋白来激活相应基因的表达，执行获得型功能基因的筛选。
非编码DNA大约占人类总基因库的98%，以前这些DNA被人们视作垃圾DNA，但随着科学技术的发展，越来越多的研究表明非编码DNA在基因表调控，肿瘤发生，生长发育方面起着重要作用[4]。非编码DNA中存在着增强子，沉默子，衰减子等功能元件，但应用传统技术很难将这些功能元件研究清楚，而随后的一些研究表明，用CRISPR筛选文库可以大大促进该领域的研究，其不仅工作量少，还可以在直接在细胞内发现特定的功能序列并且具有一定的系统性。
二、研究意义
本课题采用CRISPR活化文库，通过构建dCas-VP64激活表达系统探究哺乳动物细胞内雌激素基因关键靶点。哺乳动物细胞内基因表达调控十分复杂，这对CRISPR筛选系统也是一种巨大的挑战，尤其保证设计的sgRNA脱靶率低更是难上加难；另外对于雌激素，该物质与人体许多疾病的产生息息相关，若是能探索到一些有关该基因表达调控的关键信息，也是极好的。本次研究旨在探取雌激素表达调控的有关控制元件或产生非编码RNA的作用，并为CRISPR筛选系统在哺乳动物细胞内应用的一次扩充。
三、课题研究内容
1.利用分子克隆技术构建dCASE-VP64激活表达系统。
对于筛选系统的构建，一般有两种方法[6]：一是单一载体运载，该方法将dCas-VP64融合体与sgRNA放入同一载体内，这样能够在细胞内同时表达dCas-VP64与sgRNA增强了系统的有效性，该方法的缺点为运载序列太长，不易设计载体[7]；第二种方法是分别用两个载体运载dCas-VP64与sgRNA，这样可以减少载体的负担，但同时为同种sgRNA进入细胞调控增加了工作难度。至于详细的构建载体方法尚未确定。
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