集基因治疗与化疗于一体的光敏型阳离子脂质体合成文献综述

 2022-12-12 19:48:08

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题背景

脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，占所有原发性中枢神经系统肿瘤的 32%，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌（位列第3位），是35岁以下肿瘤患者的第 2 位死亡原因。脑胶质瘤中一半以上是恶性程度最高的多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiform，GBM）[1]。GBM是Ⅳ级脑肿瘤，年发病率为5times;10 minus;6 ～8times;10 minus;6 ，具有生长迅速、侵袭性强等特性，使得手术彻底切除困难，极易复发[1-2]。替莫唑胺（TMZ）是第二代口服烷化剂，易通过血脑屏障，是临床治疗恶性脑胶质细胞瘤的标准一线化疗药。替莫唑胺可明显改善恶性胶质瘤患者的预后，与传统化疗药物相比，其骨髓抑制等严重不良反应较轻，并且有近100％的生物利用度[3-4]。替莫唑胺主要攻击肿瘤细胞 DNA，造成 DNA 烷基化损伤，主要发生在 N3、N7、O6 位鸟嘌呤和 O3 位的腺嘌呤处，进而形成 DNA 交联，导致癌细胞死亡[5]。临床研究表明，TMZ 对人恶性脑胶质瘤的有效率在 45%左右。GBM 对 TMZ 的耐药性是化疗失败的主要原因，究其原因，是因为肿瘤细胞对替莫唑胺具有原发或继发性耐药作用。肿瘤细胞对替莫唑胺的耐药机制复杂，包括各种途径的DNA修复，多种细胞凋亡途径异常[3-4]。即使采用了最为积极的治疗手段，GBM 患者中位生存期仍然少于 15个月。已有文献研究证明哺乳动物 mTOR 是一种不典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于 PIKK 家族成员，相对分子质量为 289。mTOR 激活后影响核糖体 S6蛋白激酶和真核细胞始动因子 4E 结合蛋白合成关键调节因子，影响细胞的生长和分化。该文章表明随着胶质瘤恶性程度的增加 mTOR 蛋白阳性率明显增加，mTOR可能在胶质瘤的恶性演进中发挥着重要作用[10]。脂质体(Liposome)或称类脂小球、液晶微囊,是将药物包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间所制成的超微型球状载体制剂[6]。由于脂质体结构的多功能性 , 其可传递多种药物,包括化疗药物、免疫调节剂 、螯合剂 、血色素和基因药物等 。脂质体作为药物载体具有靶向、增效减毒、延长药效、避免耐药等优点[7]。而且阿霉素脂质体注射液Doxil是美国食品药物管理局(FDA)最早批准的临床抗肿瘤纳米药物,粒径分布 在60一120nm范围[8]。本文旨在利用温敏型脂质体作为TMZ的载体，同时利用lbl脂质体技术将抑制GBM耐药性的miRNA 包裹在温敏型脂质体外部[9]，以此达到化疗与基因治疗的结合并且利用温敏型脂质体的光热转换达到TMZ的可控释放。

  1. 要解决的问题
  2. 筛选对温度敏感但有有一定稳定性的脂质体合成原料配比；
  3. 选择脂质体合成方法以及摸索合成过程中的最佳条件；
  4. 替莫唑胺上载到脂质体内部的方法选择；
  5. miRNA上载工艺摸索与完善；
  6. 脂质体保存条件以及保存时间的摸索；
  7. 可行性分析
  8. 本实验室已有合成温敏型脂质体的基础，即将一种疏水性荧光染料Cypate(CYP)掺杂进入双层热敏脂质体层中用于光热转化，以实现近红外照射下，脂质体内亲水内核中的替莫唑胺的光热可控释放。
  9. 国外已有文献报道可在脂质体或纳米粒子外层包裹聚-L-精氨酸，双层聚-L-精氨酸之间可有效上载3500个miRNA分子，并且可以使脂质体的半衰期延长28h[9]。
  10. 如今脂质体合成工艺已经较成熟，且已有硫酸铵梯度法制备载药阿霉素脂质体的成熟工艺，同法可利用硫酸铵梯度法制备载药替莫唑胺脂质体。
  11. 脂质体具有较强的生物降解能力，较大的包载空间，对亲水和疏水性药物均具有良好的生物相容性，并且具有较长的半衰期和低毒性的优点，是一种极具前景的药物传输载体。
  12. 有足够的文献支持理论的正确可行性。
  13. 研究方法和内容
  14. 脂质体合成方法

薄膜法：是脂质体制备方法中最原始、最基本和现今任广泛应用的方法[8]。我们采用旋转蒸发仪通过控制转速、温度和压力使圆底烧瓶内壁形成一层薄膜，干燥后再加入特定水溶液水化，同时利用旋转蒸发仪的旋转使脂质悬浮，最后利用超声使悬浮脂质均匀的分散。

  1. 替莫唑胺上载法

硫酸铵梯度法:在水化的步骤选用200mmol/mL的（NH4)2SO4 溶液加入到制备好的膜中水合30min，水合后再使用超声，使脂质体均匀分散。之后以生理盐水为透析液，每1h换一次液，透析3h。将游离的（NH4)2SO4除去。最后加1mL 1mg/mL的替莫唑胺于脂质体中，在37℃水浴中载药，微微搅拌30min。

  1. RNA电荷吸附包裹法

顺序层积法：薄膜法合成脂质体带负电荷，将带负电荷的脂质体混合于聚阳离子（poly-l-arginine）的无RNase去离子水溶液中，3~5s的超声使聚精氨酸均匀吸附至脂质体外层，之后经过15000rpm/min离心20min除去未吸附的聚精氨酸。纯化后的脂质体混合于RNA水溶液中，静置过夜再离心纯化（同上）。可重复上述步骤直至获得足够的上载量，最后再在最外层通过静电吸附包裹一层聚精氨酸[9]。

  1. 脂质体的表征
  2. 脂质体的稳定性检验
  3. 工作计划

2月28日—3月17日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。

3月18日—5月10日：完成脂质体合成、表征、稳定性检验工作。

5月11日—5月20日：完成毕业论文的撰写工作。

5月21日—6月03日：完成毕业论文的评阅与修改工作。

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