文献综述
课题研究的现状及发展趋势：
DHEA（Dehydroepiandrosterone，去氢表雄酮）可作为保健品添加剂，是一种内源性类固醇激素。在人体中由肾上腺、性腺和大脑分泌。DHEA也具有可以与细胞核和细胞表面受体结合，并作为神经甾体和神经营养因子受体的调节剂等多种生物学效应。它在体内主要以两种形态存在：DHEA（DHEA的非硫酸化形式）和DHEAS（DHEA的硫酸化形式）。它们都是脑内具有营养和保护功能的神经活性神经甾体，与大脑中的几个主要受体系统相互作用，包括谷氨酸受体、sigma;受体和gamma;-氨基丁酸A型受体[1]。DHEA对延缓衰老、提高记忆力、保护女性卵巢[2]等方面有一定的保健功效。它可以作为中间物用于生产甾体激素类药物，倪瑜[3]等人从土壤中筛选一株亚麻刺盘孢ST-1（Colletotrichum liniST-1）菌株，可以直接催化底物DHEA得到双羟化产物三羟基雄甾烯酮。甾体类药物近几年随着生物转化技术的不断成熟，在市场上销售额也不断提高。在2011年已成为产量第二多的药物，仅次于抗生素[4]。
耻垢分枝杆菌，分离自包皮垢是一种无致病性且生长迅速的分枝杆菌，它可以代替结核分枝杆菌作为研究结核病的模式生物。许多药物类固醇目前是通过微生物侧链分解天然甾醇合成来替代多步骤化学合成。这些合成物通常是通过使用环境隔离的微生物或其常规突变体的发酵过程产生的，改造后的耻垢分枝杆菌能够使用胆固醇作为唯一的碳源和能源来生长[5]。然而，这种特性还没有被开发用于类固醇（如去氢表雄酮）合成的工业生产。
生产DHEA的方法主要有化学合成法和生物转化法。化学合成法的不足之处在于对环境污染较大，步骤复杂且合成产生的副产物多，因此生物转化法是目前研究的热点。生物转化法具有成本低、收率高、污染小、条件温和、产物立体选择性强等优势。Meio等[6]在1958年生物法合成DHEA，体系中中需Mg2＋和ATP或还原型辅酶Ⅰ增强活性。生物转化技术在甾体生产中的两大方向分别是:对甾体化合物上特定的位点进行改造和修饰，生成具有生物活性的化合物和将天然原料（如植物甾醇）转化为产甾体化合物的中间体[7,8]。
2012年刘喜荣[9]等人使用甾醇为原料，将甾醇的3位羟基进行保护，得保护物，再将保护物用耻垢分枝杆菌进行发酵。最后将发酵产物进行水解得到DHEA。宋浩雷[10]等在2014年公开的专利中提出了一种利用重组耻垢分枝杆菌在单水相发酵体系中利用植物甾醇生产DHEA的方法。他们敲除特定基因元件后通过构建重组菌株，得到基因重组过的耻垢分枝杆菌。进行种子扩培后，在单水相发酵体系中转化植物甾醇生产DHEA。有人还尝试过从天然产物中直接分离提取DHEA，1936年德国一专利报道称可从人体组织、体液、代谢物（如脑垂体叶、孕妇的血液和尿液）分离出DHEA[11]。
生物转化法的好处虽多，但是其过程也有很多难点。转化率的高低受生物转化过程中底物的溶解和传递效果的影响[12]。甾体类药物（如DHEA）溶解度低、疏水性强，导致底物与发酵过程中微生物分泌的用于转化的酶接触不好，从而降低转化率，延长发酵周期。所以增加底物的溶解性是解决技术难题的关键。Smith等利用分枝杆菌，以胆固醇为底物进行转化。他在培养基中添加了胆固醇的乳浊液2%和吐温-80（体积分数），发现加入了吐温-80与胆固醇的乳浊液的转化效率更高，比仅用超声波处理的胆固醇悬浊液的转化时间缩短了2-3 d[13]。这说明加入一定量的表面活性剂，不仅有助于提高底物溶解度，还可以提高转化效率。表面活性剂还可以“储存”底物，一定程度上可以改善产物对微生物的反馈抑制。除了底物甾醇在水中溶解度低、传递效率低等原因，转化产物的抑制作用及降解、对微生物有毒害等问题，也限制了分枝杆菌生物转化甾醇这一工艺路线的工业化生产[14]。本实验室之前已经获得了一株耻垢分枝杆菌MSMEG_5228敲除突变株，期待通过液体发酵的方式获得DHEA。
高效液相色谱法（HPLC）、薄层层析法（TLC）、气相色谱质谱（GC/MS）联用技术是DHEA主要检测方法，除此之外还有放射免疫测定法和库仑滴定法等方法[15,16]。
2001年，黄宏南[17]等人建立了一种测定某保健品胶囊中DHEA含量的HPLC法，固定相为shim-pack CLC-ODS柱，流动相比例为乙腈：水(40：60)，检测波长为215 nm。2002年，赵春景[18]等人用HPLC法检测DHEA片剂，他们用mu;-Bondapak C18柱，流动相比例为甲醇：水(75：25)，检测波长为292 nm。2015年，陈晓静[19]等人采用固定相为Diamonsil C18色谱柱，检测条件为流动相比例为乙腈：水(55：45)，流动相流速为1.0 mL/min，进样量为20 mu;L，检测波长为206 nm，柱温为室温。在以上几人建立的检测条件下，DHEA与其他杂质分离程度较好。同年，唐洁[20]采用210 nm的紫外检测波长，流动相为甲醇：乙腈：水（36:24:40）的检测条件结果更加准确。目前，HPLC是检测DHEA的主要方法，但DHEA的HPLC检测条件差异较大，结果也不尽相同。所以选取合适的检测条件对DHEA的检测十分重要。
本课题研究的意义和价值:
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