姓名

米日班·哈尼克

学号

16408512

专业

环境科学

指导教师

廖千家骅

课题名称

四环素类抗生素对水-沉积物系统中产甲烷的作用机制研究

课题性质

radic; 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1.前言

城市化进程的加快和工业生产规模的不断扩大，直接导致城市生活污水、工业废水排放量的急剧增长，污染物种类和浓度也随之增加，对人类的生存环境和生活质量构成了很大的威胁^[1]。由此造成的水环境污染问题也日益突出，并且成为水安全危机的重要推手^[2]。

近年来，由于抗生素在抗菌抑菌方面的重要作用，被广泛应用于人类临床诊治及动物疾病的预防和治疗当中 ^[3]。随着我国水产养殖业的迅速发展，抗生素因其能够有效促进水产品的生长、预防和治疗感染性疾病而被广泛使用，一方面，抗生素的使用对动物的快速、健康生长作出了重要贡献; 另一方面，不能被人体或者动物完全吸收的抗生素以母体或其它代谢产物的形式随粪便和尿液排出^[4,5]，进入环境中，不仅对人类的健康造成不利影响，还对生态环境造成污染^[6,7]。

研究表明，抗生素越来越多地在世界各地的水环境体系中出现，并逐渐成为环境科学研究领域中的热点问题^[8,9] 。抗菌药物在水产养殖中的大量使用，不可避免地造成了抗菌药物在水-沉积物体系中的残留。徐磊等研究了湖州地区水产养殖池塘中的典型抗生素污染情况，结果表明有70%-80%的抗菌药物最终进入环境中^[10]

。

2.抗生素的使用现状

抗生素是指由细菌、真菌或其它微生物在活动过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类物质。根据抗生素的化学结构和临床用途，可将抗生素分为beta;-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、林可霉素类、四环素类、磺胺类、氯霉素类以及其他类等。

2002年，全世界每年抗生素的使用量大约为10-20万吨^[11]。 对于不同国家和地区，抗生素的使用模式有所不同。《世卫组织抗生素消费监测报告》调查了65个国家的抗生素使用情况，结果显示：荷兰每一千人的抗生素用量达9.78个限定日剂量，而英国和土耳其的使用量分别是荷兰的两倍和四倍，即土耳其的每千人用量达38.18个限定日剂量。瑞典有报道证实，在某医院排放的废水中检测到高浓度的抗生素药物，磺胺甲恶唑、甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星、氧氟沙星等抗生素的浓度都很高，超过环境中该种药物浓度的百倍甚至千倍^[12]，这些污水必将对环境造成严重且深远的影响。据报道，美国每年使用的2.27万吨抗生素中，大约有50%用于人类医疗，剩下的 50%用于动物、农业和水产养殖业^[11]。

我国是抗生素生产和使用大国。2003年，我国青霉素的生产量为 2.8 万吨(占世界生产总量的60%)，土霉素的生产量为1万吨( 占世界生产总量的65%)^[13]。据统计，在中国使用和销售排列在前15位的药品中，就有10种是抗生素类药物。我国住院患者的抗生素使用率高达80％，其中使用广谱抗生素和联合使用的抗生素占58％，远远高于30％的国际水平^[14]。此外，畜牧业中抗生素的使用也十分普遍，我国每年有 5000-7000 吨土霉素和 750-1000 吨金霉素用于动物养殖业; 农业中使用的抗生素种类已经包括了全部医用抗生素种类^[15]。2013年，我国一半以上的抗生素用于水产养殖业^[16]。阮悦斐等的研究表明，淡水养殖区表层水中环丙沙星、 诺氟沙星和土霉素的检出率较高，浓度范围在10.5～26.8mu;g/L 之间^[17]。

3.环境中抗生素的来源和残留

3.1 环境中抗生素的来源

环境中的抗生素主要来源于人类活动，主要包括医用抗生素、畜牧养殖、水产养殖和工厂排放等，其具体来源及迁移途径如图1.1所示。

研究证明，大多数抗生素在环境中不能轻易且快速地被降解成小分子无机物，难以被完全去除，因而在环境中有着持久的危害性。抗生素类药物的直接丢弃也是环境中抗生素的来源之一，对周边环境有直接危害。排入环境中的抗生素首先进入地表水，通过雨水冲刷、地表径流、土壤渗滤和地下径流等途径对地表水和地下水造成污染，进而会对人类的饮用水也产生污染。在水产养殖中，大量的抗生素被直接投加到水体中，对地表水直接造成污染，抗生素还会由于吸附、沉积、螯合等作用进入到底部沉积物中，不易被降解。湖泊、池塘、水库等地表水水域中的抗生素残留，可能对水体中有益微生物的活性有抑制，还可能进入到水生生物体内，通过食物链进行富集。另外，由于抗生素的广泛生产和使用，造成抗生素滥用的现状，导致生物机体对该药物的敏感度下降而产生耐药性，对疾病的有效治疗产生不利的影响。

图1 环境中抗生素主要来源及迁移途径

3.2 抗生素在环境中的残留

大部分抗生素不能完全被机体吸收或消化分解，大量的抗生素以原形或代谢物形式经由病人和禽畜粪尿排入环境，经不同途径进入土壤和水体环境中，从而造成污染。在对土壤环境的检测中，发现抗生素残留已达 11～300mu;g/kg, 其含量已接近于其他农药类有机污染物的含量水平^[18]。我国福建九龙江流域的5个污水处理厂出水中都检出了高浓度的SAs、MLs和beta;-Ls三大类抗生素^[19]。Lara-Martin 等发现污水处理厂采集到的柱状沉积物中药物的总浓度随着沉积深度的增加而相应减少，表层沉积物检出最大值（98ng/g）^[20]。陈奕涵的研究了东江源区水体的抗生素残留，发现水体中总抗生素含量为193.59-863.27ng/L，枫树坝水库沉积物中总抗生素赋存水平范围为115.132～273.01mu;g/kg，平均含量为194.53mu;g/kg，对其进行风险评估表明，四环素类抗生素处于高风险，应予以优先控制^[21]。可以看出，水-沉积物体系是抗生素在环境中的重要归宿之一。

4.水-沉积物体系中甲烷的释放

4.1 甲烷对全球变暖的影响

甲烷是结构最简单的烷类，甲烷的结构是由一个碳和四个氢原子通过sp3杂化的方式化合而成，并且是所有烃类物质中，含碳量最小，也是自然界中最简单的有机物，是天然气、沼气、坑气等的主要成分。甲烷可用来作为燃料及制造氢气、炭黑、一氧化碳、乙炔、氢氰酸及甲醛等物质的原料。

工业革命以来，随着工业化程度的快速推进，大气中的温室气体含量不断增加，加剧了全球变暖和极端气候事件的发生，碳排放成为各国争议的重要话题。大气中的温室气体主要有H₂O(g)、CO₂、CH₄等，其中甲烷对全球变暖的贡献在主要温室气体中排第二位（占20%），仅次于二氧化碳（占60%），对全球温室效应的贡献率为 18%。更有数据表明，人类工业化活动使得近百年来大气中的CH₄浓度上升了一倍多，如果不对CH₄的来源加以控制，未来50年内CH₄对温室效应的贡献将达到 CO₂的25%^[22]。甲烷作为第二大温室气体，其增温效应是二氧化碳的28倍，排放到大气中的甲烷可以在全球范围实现输送和混合，对气候变化有着重要的影响。

4.2水-沉积物体系对甲烷总量的贡献

在全球范围内，湖泊甲烷排放量占天然甲烷排放总量的6-16%^[23]。与美国和欧洲国家相比，由于我国湖泊的富营养化程度较高、有机质输入量大及湖泊深度较浅等原因，甲烷排放通量相对较高^[24,25]。湖泊生态系统中产生的甲烷在扩散进入大气之前，有相当部分会被甲烷氧化微生物利用，Alaska 湖一年中输入的碳有55%被转化为甲烷，但其中36% 的碳又经甲烷氧化被再次利用; Matano 湖产生的甲烷有50%，极端情况时甚至会有90%被氧化过程消耗。由此可见，甲烷氧化微生物在有效降低湖泊对温室效应的贡献方面发挥着重要作用^[26]。

4.3 厌氧状态下抗生素对产甲烷作用机制的影响

当产甲烷菌存在于不同的体系中时，由于体系中的可利用底物及环境条件不同，产甲烷菌的活性也不尽相同，不同的抗生素对产甲烷菌的活性作用不同，而同一种抗生素在不同浓度作用下，对产甲烷菌的影响也不相同。有研究表明林可霉素主要通过抑制丁酸互营氧化菌的活性，以降低乙酸产量从而降低甲烷产生量，50mg/L的核糖霉素主要抑制乙酸型产甲烷古菌活性，而红霉素、螺旋霉素、氯霉素、头孢唑啉和四环素可同时抑制产甲烷古菌和丁酸互营氧化菌活性^[27]。目前关于土霉素对产甲烷影响的研究大多致力于厌氧污泥消化方面。例如，余博等研究了土霉素在污泥中的中温厌氧消化，结果表明高浓度的土霉素会对产甲烷古菌有一定的抑制作用，短期内，浓度为50和500mg/L的土霉素对抑制了甲烷的产量分别为23.75%和90.67%^[28]。Nimilni等研究了在55℃时进行的厌氧消化，发现土霉素在30，60和90mg/L的浓度下，甲烷的产生量分别是对照组产甲烷量的79.1%，70.3%，68.6%^[29]。得出的结论均表明土霉素对产甲烷有抑制作用，而且随着土霉素浓度的增加，对甲烷产生量的抑制作用越明显。关于土霉素在水-沉积物体系中对产甲烷影响的研究却几乎没有，因而必要对其展开探究。

5. 研究目的、内容以及意义

5.1 研究目的和意义

土霉素是四环素类抗生素的一种，是一种广谱性半合成抗生素，是抑菌而非杀菌性药物。研究表明，子牙新河下游河流沉积物中土霉素的检出浓度最高，为648mu;g/kg，与水体中一致。沉积物中土霉素的平均检出浓度也高于其他种类的抗生素，表明由河流下游到浅海区域水体和沉积物抗生素的主要污染类型为四环素类^[30]，因此对土霉素在水-沉积物体系中的研究显得尤为必要。

图2 土霉素基本信息

目前，由于抗生素的滥用从而引起一系列的关于环境安全的问题，也因此致使抗生素成为研究的热点课题。土霉素是四环素类抗生素中应用广泛、使用量大的一种典型抗生素，其水溶性较好，性质稳定，使用后可通过多种途径进入环境中从而导致环境细菌耐药性的产生和传播。甲烷是重要的温室气体，湖泊产甲烷占水体产甲烷的60%，而湖泊中产甲烷主要途径是沉积物中产甲烷菌的产甲烷作用。而关于土霉素在水-沉积物体系中对厌氧产甲烷的研究报道非常之少。本课题拟探究不同浓度的土霉素对于水-沉积物体系中厌氧条件下甲烷产生量的影响，并分析厌氧培养期间体系中的微生物菌落结构、土霉素的浓度变化及其转化归趋。旨在为进一步研究土霉素对甲烷产量的影响机制及自身的降解机制提供理论基础。

5.2 实验研究的内容

为探究四环素类抗生素对水-沉积物系统中产甲烷的作用机制，本研究主要内容如下:

1、水-沉积物体系中水和沉积物的样品采集及其理化性质的测定；探究沉积物中提取回收土霉素的方法，对回收方法进行条件优化，找寻能够得到更高回收率的提取途径；使用高效液相色谱法测定提取之后的土霉素含量，对测定的色谱条件进行优化，获得最佳测定条件；调研土霉素的实际投加方式、使用量和水-沉积物体系的残留量。

2、根据相关文献和资料，设置实验中土霉素在体系中的投加浓度；设计装置使培养过程中体系处于厌氧状态下，探究不同浓度的土霉素对于体系中甲烷产生量的影响；使用气相色谱仪定期测定体系中甲烷的含量，分析不同体系中甲烷含量随时间的变化关系。

3、厌氧培养期间，定期取沉积物淤泥的微生物样品，经过样品的纯化后，对16S rRNA基因进行Illumina测序，以确定产甲烷菌群落，评价细菌群落组成和多样性变化，分析水-沉积物体系中微生物菌落结构随时间的变化情况。

4、厌氧培养期间，定期采取体系中的水和沉积物样品，使用优化的提取方法提取土霉素之后，进HPLC检测其含量，分析土霉素在培养期间的浓度变化情况；对投加¹³C标记的土霉素组别，使用GC-MS技术，结合同位素示踪法，分析土霉素的降解产物，剖析土霉素在厌氧培养过程中的可能降解途径。

5.3 技术路线

图3 技术路线框图

参考文献

[1]高俊红, 谢晓芸, 张涵瑜, 等. 三种氟喹诺酮类抗生素在黄河沉积物中的吸附行为[J]. 兰州大学学报（自然科学版）, 2016, 052(005):593-598.

[2] Castelein S, Otte A. Conflict and Cooperation related to Internation Water Resources: Historical Perspectives [A]. Selected Papers of the Water History Associationacute;s Conference on The Role of Water in History and Development Bergen，Norway 10-12 Augest 2001 ，IHP-VI. Technical Documents in Hydrology (TDH) [C].Pairs : UNESCO，2002：198-206

[3] 孟玉玲, 赵娟. 抗菌药物的不良反应分析以及预防措施[J]. 养生保健指南：医药研究, 2016,5(3):216-216.

[4] Jjemba P K. The potential impact of veterinary and human therapeutic agents in manure and biosolids on plants grown on arable land: a review[J]. Agric Ecosys Environ, 2002, 93 (13):267- -278.

[5] Teeter J S, Meyerhoff R D. Aerobic degradation of tylosin in cattle, chicken, and swine excreta[J]. Environ Res, 2003, 93 (1):45-51.

[6] Li Y, Liu B, Zhang X, et al. The distribution of veterinary antibiotics in the river system in alivestock-producing region and interactions between different phases[J]. Environ Sci Pollut, 2016, 23:16542–16551.

[7] 俞道进, 曾振灵, 陈杖榴．四环素类抗生素残留对水生态环境影响的研究进展[J]. 中国兽医学报, 2004, 24( 5) : 515-517：

[8] Lindsey M E, Meyer M, Thurman E M. Analysis of trace levels of sulfonamide and tetracycline antimicrobials in groundwater and surface water using solid-phase extraction and liquid chromatography / Mass Spectrometry ［J］. Analytical Chemistry, 2001,73(19) : 4640-4646

[9] 赵晓艳, 刘丽君, 聂湘平, 等．利用多物种净水监测仪在线监测水体抗生素药物及有机磷农药［J］. 环境科学学报, 2010,30( 1) :180-185

[10] 徐磊, 孙博怿, 盛鹏程, et al. 湖州地区典型水产养殖池塘中抗菌药物的污染特征[J]. 江苏农业科学, 2019, 047(011):210-214.

[11] Kuuml;mmerer K. Antibiotics in the aquatic environment-A review-Part I［J］. Chemosphere，2009，75( 4) : 417-434

[12] 钟振兴. 磺胺抗生素在湖泊沉积物中的吸附和降解行为研究[D]. 西南大学, 2012.

[13] Richardson B, Lam P, Martin M. Emerging chemicals of concern: Pharmaceuticals and personal care products ( PPCPs) in Asia，with particular reference to Southern China[J]. Marine Pollution Bulletin, 2005, 50( 9) : 913-920

[14]李贞, 段文海, 邵蓉. 我国抗生素使用现状分析[J]. 国际医药卫生导报, 2005,(21):81-82.

[15] 曾化松, 王艳琳．抗生素滥用的现状及应对策略［J］．中国卫生事业管理，2012,5: 341-343

[16]赵起越, 李令军, 荆红卫, 等. 水产养殖业使用抗生素造成的地表水污染及检测方法[J]. 分析试验室, 037(1):103-107.

[17] 邓旺明, 李浩瑜, 刘士涛, 等. 水产养殖业抗生素在水环境中的迁移转化[J]. 广东化工, 043(3):91-92.

[18] 贾江雁, 李明利. 抗生素在环境中的迁移转化及生物效应研究进展[J]. 四川环境, 2011(01):125-129.

[19] 梁帅. 澜沧江、雅鲁藏布江抗生素分布特征及其风险评价[D].中国地质大学(北京),2019.

[20] 连璐璐. 抗生素在滨海养殖区表层及柱状沉积物中的分布特征[D]. 大连理工大学, 2016.

[21] 陈奕涵. “河流-水库”系统水环境典型污染物赋存特征的研究[D].上海交通大学,2018.

[22] 王艳飞. 厌氧消化过程中温度对产甲烷代谢途径及微生物群落结构变化的影响研究[D]. 云南师范大学, 2019.

[23] Bastviken D, Cole J, Pace M, et al. Methane emissions from lakes: Dependence of lake characteristics, two regional assessments, and a global estimate[J]. Global Biogeochemical Cycles, 2004, 18(4).

[24] Yang H, Xie P, Ni L, et al. Underestimation of CH4 Emission from Freshwater Lakes in China[J]. Environmental Science amp; Technology, 2011, 45(10):4203-4204.

[25] Tianli, Tong, Shuguang, et al. Impacts of sulfanilamide and oxytetracycline on methane oxidation and methanotrophic community in freshwater sediment.[J]. Ecotoxicology, 2019.

[26] 唐千, 薛校风, 王惠, 等. 湖泊生态系统产甲烷与甲烷氧化微生物研究进展[J]. 湖泊科学, 2018, v.30(03):19-32.

[27]马清佳, 田哲, 员建, 等. 9种抗生素对污泥高温厌氧消化的急性抑制[J]. 环境工程学报,2018,12(07):2084-2093.

[28]余博, 田哲, 池勇志, 等. 土霉素对剩余污泥中温厌氧消化的短期和长期影响[J]. 环境工程学报,2016,10(04):2009-2015.

[29] Nilmini Beneragama, Suraju A Lateef, Masahiro Lwasaki, et al. The combined effect of cefazolin and oxytertracycline on biogas production from thermophilic anaerobic digestion of dairy manure[J]. Bioresour Technol, 2013, 133:23-30.

[30] 刘兴华. 黄河三角洲滨海土壤和沉积物颗粒态有机质特性及其对抗生素吸附作用研究[D]. 中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所), 2018.

学生签名： 米日班.哈尼克 2020 年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室审查意见：

负责人签名： 年 月 日