1.课题背景及研究概述
脑卒中（Cerebral stroke）又称中风，是一种急性脑血管疾病，起因于脑部血管突然破裂或阻塞导致大脑血液供应中断，脑组织损伤，神经功能出现缺陷[1]。卒中后认知障碍（post-stroke cognitive impairment, PSCI）是脑卒中最常见的一种并发症，指的是在卒中事件后六个月内出现达到认知障碍诊断标准的一系列综合征，涵盖了非痴呆认知障碍（Cognitive impairment no dementia, CIND）至卒中后痴呆（post-stroke dementia, PSD）的不同程度的认知障碍。识别和处理早期PSCI有助于干预症状发展，改善患者预后，提高生活水平[2]。
本课题欲通过大鼠脑卒中后认知功能障碍模型，探讨吡拉格雷钠对PSCI的药效作用及相关机制研究，为临床研究提供数据支持。
课题研究方向拟定为：脑损区海马组织胆碱能神经环路及组蛋白乙酰化的稳态平衡，脑卒中导致脑内p-CREB、CBP和Ac-H3蛋白（乙酰化组蛋白）减少，胆碱能神经环路乙酰化内稳态失衡，ChAT基因M型启动子组蛋白乙酰化程度降低，ChAT基因转录减少（ChAT乙酰胆碱转移酶）Ach生成减少，认知功能下降。
2.预期目标
通过模型大鼠与其他组给药后的行为学评分比较，评价吡拉格雷钠对脑缺血再灌注损伤的改善作用，用大脑内各生化指标推测模拟出吡拉格雷钠的作用机制。
3.实验内容与方法
3.1 大鼠大脑中动脉栓塞模型的建立
本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞模型（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）模拟脑缺血再灌注损伤。通过大鼠颈外动脉切口插入硅胶头线栓，到达大脑中动脉起始处，阻塞大脑中动脉，记为缺血开始。缺血60分钟后，取出线栓，待大鼠清醒后放回笼中喂养。假手术组除不插入线栓外，其他步骤同与手术组。
3.2 大鼠全脑缺血模型的建立
通过永久性结扎双侧椎动脉结合短时间阻断双侧颈总动脉造成前脑完全性缺血，特别是海马神经元的缺血性损伤而成功造模[3]。
3.3 动物分组及给药
雄性SD大鼠，选造模后评分1-3分的大鼠随机分为6组，分别为吡拉格雷钠20mg/kg、30mg/kg、45mg/kg剂量组、奥扎格雷钠30mg/kg剂量组、模型组和假手术组（给予同等生理盐水），尾静脉给药0.2ml/100g体重，连续给药7天。
3.4 神经行为学评分
MCAO 24h后按Bederson[4]的方法对动物的行为缺陷进行评分，满分为4分，分数越高，动物行为障碍越严重。
神经行为评分标准
|
分值 |
神经行为学表现 |
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0分 |
未观察到神经症状，行为正常 |
|
1分 |
提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁 |
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2分 |
将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低 |
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3分 |
动物自由行走时向手术对侧环转或转圈 |
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4分 |
软瘫，肢体无自发活动 |
3.5 脑组织梗死率及脑含水量测定
MCAO 24h后，断头处死大鼠，取出全脑并称湿重。脑切片后置5ml含有1% TTC的磷酸缓冲溶液中，避光，37℃水浴温孵30min，每隔7～8min翻动一次，用眼科镊分离苍白区（梗塞区）和非苍白区（正常区）。
脑梗塞百分比（%）=苍白区重量/（苍白区重量＋非苍白区重量）times;100%
将染色后的脑组织置于100℃烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑含水量如下：
脑组织含水量（%）=（1－脑组织干重/脑组织湿重）times;100%
3.6 脑组织生化学指标测定
3.6.1 ELISA测定p-CREB、CBP和Ac-H3含量
MCAO造模24h后，将各组大鼠断头处死，立即于冰浴上取出全脑，快速剔除嗅球、小脑和低位脑干后，将大脑右前约一半组织以冰冷的生理盐水制成10%脑组织匀浆。按试剂盒说明书方法测定相关指标含量。
3.6.2 Western blot测定ChAT蛋白表达
MCAO造模24h后，取大鼠造模侧海马组织，冰上放置30min，12000rpm离心5min，吸取上清，用BCA试剂盒进行蛋白定量。取50mu;g上样量恒压电泳分离，半干法将PAGE胶中蛋白转印至PVDF膜上，恒流电转移后染色、标记。根据抗体说明进行抗体包被、温孵、进行化学发光反应。扫描或拍照成像后进行分析。
3.7 统计分析
实验数据采用SPSS软件进行统计学分析。实验数据以均数plusmn;标准差（plusmn;s）表示，采用SPSS软件进行多组间单因素方差分析，组间两两比较采用LSD和Dunnetts T3法，方差不齐采用非参数秩和检验Krustal-wallis test法进行比较分析，Plt;0.05为差异有显著性。
4.参考文献
[1] 樊文香. 缺血性脑卒中的机制研究进展[J]. 中国药科大学学报, 2018, 49(06): 751–759.
[2] 中国卒中学会，卒中后认知障碍管理专家委员会（执笔：董强，郭起浩，罗本燕，徐运）, CHINESE STROKE ASSOCIATION the C on the M of C D after S (Byliner: D Q. 卒中后认知障碍管理专家共识[J]. 中国卒中杂志, , 12(6): 519–531.
[3] ZHANG J，MENG L，QIN W，et al．Structural damage and functional reorganization in ipsilesional ml in well—recovered patients withsubcortical stroke[J]．Stroke，2014，45( 3) : 788.793
[4] Bederson JB, Pitts LH, Tauji H, et al. Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke, 1986, 17(3): 472-6.
1.课题背景及研究概述
脑卒中（Cerebral stroke）又称中风，是一种急性脑血管疾病，起因于脑部血管突然破裂或阻塞导致大脑血液供应中断，脑组织损伤，神经功能出现缺陷[1]。卒中后认知障碍（post-stroke cognitive impairment, PSCI）是脑卒中最常见的一种并发症，指的是在卒中事件后六个月内出现达到认知障碍诊断标准的一系列综合征，涵盖了非痴呆认知障碍（Cognitive impairment no dementia, CIND）至卒中后痴呆（post-stroke dementia, PSD）的不同程度的认知障碍。识别和处理早期PSCI有助于干预症状发展，改善患者预后，提高生活水平[2]。
本课题欲通过大鼠脑卒中后认知功能障碍模型，探讨吡拉格雷钠对PSCI的药效作用及相关机制研究，为临床研究提供数据支持。
课题研究方向拟定为：脑损区海马组织胆碱能神经环路及组蛋白乙酰化的稳态平衡，脑卒中导致脑内p-CREB、CBP和Ac-H3蛋白（乙酰化组蛋白）减少，胆碱能神经环路乙酰化内稳态失衡，ChAT基因M型启动子组蛋白乙酰化程度降低，ChAT基因转录减少（ChAT乙酰胆碱转移酶）Ach生成减少，认知功能下降。
2.预期目标
通过模型大鼠与其他组给药后的行为学评分比较，评价吡拉格雷钠对脑缺血再灌注损伤的改善作用，用大脑内各生化指标推测模拟出吡拉格雷钠的作用机制。
3.实验内容与方法
3.1 大鼠大脑中动脉栓塞模型的建立
本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞模型（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）模拟脑缺血再灌注损伤。通过大鼠颈外动脉切口插入硅胶头线栓，到达大脑中动脉起始处，阻塞大脑中动脉，记为缺血开始。缺血60分钟后，取出线栓，待大鼠清醒后放回笼中喂养。假手术组除不插入线栓外，其他步骤同与手术组。
3.2 大鼠全脑缺血模型的建立
通过永久性结扎双侧椎动脉结合短时间阻断双侧颈总动脉造成前脑完全性缺血，特别是海马神经元的缺血性损伤而成功造模[3]。
3.3 动物分组及给药
雄性SD大鼠，选造模后评分1-3分的大鼠随机分为6组，分别为吡拉格雷钠20mg/kg、30mg/kg、45mg/kg剂量组、奥扎格雷钠30mg/kg剂量组、模型组和假手术组（给予同等生理盐水），尾静脉给药0.2ml/100g体重，连续给药7天。
3.4 神经行为学评分
MCAO 24h后按Bederson[4]的方法对动物的行为缺陷进行评分，满分为4分，分数越高，动物行为障碍越严重。
神经行为评分标准
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