开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一.现状
骨肉瘤术后潜伏病灶复燃是影响远期治疗效果的核心问题。血管新生是骨肉瘤侵袭的重要机制，异常表达于脉管系统中的整合素可与胞外基质作用调控瘤细胞归巢。研究发现重组纤连蛋白/钙粘蛋白（rFN/CDH）可选择性激活alpha;vbeta;3整合素，将其自组装于钙磷陶瓷的生物界面兼有骨传导和骨诱导特征。将紫杉醇通过纳米粒技术“嫁接”于自组装系统，可赋予成骨修复界面抗肿瘤特征。以此修复瘤缺损可通过rFN/CDH-alpha;vbeta;3途径实现紫杉醇对肿瘤细胞的靶向募集和杀伤。拟制备紫杉醇-壳聚糖纳米粒进而构建[rFN/CDH-紫杉醇]自组装体，体内外观察对靶向募集肿瘤的杀伤效应。另共培养骨肉瘤细胞﹑血管相关细胞，从血管生成素旁分泌﹑受体络氨酸激酶Tie2活化和ECM稳态等层次，了解以alpha;vbeta;3整合素为核心的ECM重构分子事件及相关机制，以揭示血管相关细胞导致肿瘤细胞整合素差异表达，进而导致迁移能力改变的机理，针对瘤性骨缺损的修复和边缘组织的抑瘤治疗这一关键环节，我们提出如下方案：将易于理化改造的抗肿瘤治疗的一线药物——紫杉醇(Paclitaxel,PTX)通过纳米粒技术“嫁接”于 BCP/LbL/[Chi-rFN/CDH]系统，将赋予上述材料以抗肿瘤特征。研究显示自组装操作对PTX肿瘤活性并无显著影响，以此复合材料修复瘤性骨缺损可兼备边缘区的抑瘤作用。其可能机制在于： 1.通过ERP 和特异性配受体作用(rFN/CDH-alpha;vbeta;3 整合素)，对循环系统和肿瘤间室外的残存肿瘤细胞实现募集，达到局部高浓度紫杉醇对肿瘤细胞的靶向杀伤。2.通过rFN/CDH对成骨细胞﹑骨祖细胞的高效促进材料-机体骨之间的骨性愈合。
二.研究内容
1． 紫杉醇-壳聚糖可溶性纳米粒的制备及理化表征评价：通过湿沉淀-透析法制备紫杉醇-壳聚糖溶性纳米粒，观察纳米球尺寸﹑表面电荷﹑微观形态﹑体外稳定性﹑可溶性﹑酸碱性等理化特征和细胞毒性，计算载药量和包封率，作为“强化渗透-滞留效应”的初步评价。
2． [rFN/CDH-PTX] 纳米自组装体的制备及生物理化表征评价：基于“静电吸附”的层层自组装技术制备[rFN/CDH-PTX]纳米自组装体，观察微观拓扑﹑亲水性﹑rFN/CDH 紫杉醇释放曲线等体外特征，以及药物加载量﹑细胞内吞﹑紫杉醇-DNA加合物形成等体外指标。
三.拟解决的关键科学问题
1． 如何将紫杉醇分子纳入自组装体系。“纳米粒”技术克服非两性分子难以电荷化的难点，使紫杉醇与胆烷酸化壳聚糖形成可溶性耦合物，通过调整壳聚糖和rFN/CDH 的电荷参数可使紫杉醇整合入LbL体系。相关研究显示自组装技术对紫杉醇活性无显著影响(EndoK,et al. Cancer Sci. 2013;104:369-74 . Plummer R, et al. BrJ Cancer. 2011;104:593-8.)。如因紫杉醇自组装粒径较大，影响“强化渗透-滞留效应”或肿瘤耐药等原因导致紫杉醇性可行性差，可考虑采用紫杉醇作为备选方案。
2． 紫杉醇对骨髓间充质干细胞﹑成骨细胞等正常增殖﹑定向分化的抑制是影响本课题可行性的主要因素。前期结果显示：自组装体系对rFN/CDH 和紫杉醇的释放和界面上的成骨效应之间存在1-2 周的“窗口期”，即rFN/CDH 和紫杉醇纳米粒在一周内即可完成成85%释放，而成骨细胞的粘附和矿化发生于3周以后。此窗口期的存在有益于紫杉醇的降解以减少其对骨细胞活力和成骨能力的抑制。以此可期望协调抗肿瘤和抗成骨之间的矛盾。此外，通过调整自组装层数 N以达到控制杉醇装载量，进而将紫杉醇对正常组织细胞的毒害作用降到较低水平(详见可行性分析)。
3．纳米粒靶向肿瘤治疗的核心在于强化渗透滞留效应(enhancedpermeability and retention effect)， 该效应强度取决于纳米粒的理化特征，如粒径﹑粒径分布﹑表面电荷等，依赖本课题组与中国药科大学药物科学研究院的良好合作，完成紫杉醇-壳聚糖纳米粒的表征测试是体内外功能试验的重要前提。
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