基于质谱标签小分子信号放大和专属分离-LC-MS 检测蛋白类药物新方法的研究
摘要：蛋白多肽类药物因具有药物活性强、作用特异性高、毒副作用小等特点，在免疫功能、信息传导、疾病预防与治疗等方面都显示出优越的研究应用价值，引起了生命医药科学领域的广泛关注。测定生物样品中蛋白多肽类药物浓度是其新药评价过程中必不可少的环节，传统的蛋白多肽类药物体内分析方法仍面临着样品基质干扰复杂，检测灵敏度不足等问题，建立灵敏高效的分析方法具有重要的研究意义。针对以上问题本文提出了一种基于质谱标签小分子信号放大及专属分离以高灵敏的 LC-MS 法检测痕量蛋白类药物的新方法。其中
适配体功能化纳米粒子作为一种特异性选择功能化纳米材料兼具特异性识别功能团与纳米材料两者的优良特性，包括专属性高，选择性强，比表面积大，操作方便等特点，还具有制备方便，易于化学修饰等优势，可实现样品中待测药物的高效特异性富集与纯化，有效提高检测的灵敏度，在样品分析前处理方面具有很大的应用潜力。此外，基于该特异性选择功能化纳米材料还可以进一步实现质谱难以直接分析或质谱响应不良的待测蛋白类药物的检测形式的转化，从而实现信号放大，显著提高分析方法的灵敏度。基于此，本文选取凝血酶为蛋白类药物的研究示例，主要进行了以下研究工作：
实验中设计并制备了特异性识别凝血酶的适配体功能化磁性纳米颗粒（MNP@apt29）和双功能化介孔二氧化硅纳米粒子（即介孔二氧化硅粒子表面同时修饰适配体及修饰有标签小分子的金纳米粒子，简称 apt15@SiO2@AuNP@adenosine）。以 MNP@apt29 特异性识别并富集样品中凝血酶后，加入 apt15@SiO2@AuNP@adenosine 形成纳米“三明治结构”，在特定条件下释放并富集得金纳米粒子表面的标签小分子，以 LC-MS 分析检测。通过“三明治结构”的构建，实现了样品中凝血酶的纯化与富集，同时实现了凝血酶与质谱标签小分子之间的定量对应关系，从而以离子化效率高、质谱响应良好的标签小分子代替凝血酶进行 LC-MS 检测分析，有效避免了以质谱直接检测蛋白大分子的弊端，并显著提高检测灵敏度；同时通过引入大量的质谱标签小分子对待测蛋白类药物进行了数量放大，实现检测信号的进一步有效放大，从而取得质谱检测信号二次增敏效果。通过选取合适的质谱标签小分子，优化标签小分子修饰、解离、LC-MS 方法参数等条件，建立了以 LC-MS 灵敏专属检测蛋白类药物的新方法，该方法在凝血酶浓度为 0.02-10 nM 范围内线性关系良好，最低检测限为 0.009 nM，为蛋白类药物有效灵敏的定量分析提供了新方法和新思路，对推动蛋白类药物的研发和其临床应用研究具有重要意义。
关键词：质谱标签小分子，信号放大，功能化介孔二氧化硅纳米材料，LC-MS，蛋白类药物分析
1.1 蛋白多肽类药物的研究进展
蛋白多肽类药物是一类以基本氨基酸为单元按照不同序列相互连接而成的具有特殊治
疗效果的药物，主要为人体内源性物质或针对生物体内调控因子研发而得。一般认为由50 个以上氨基酸组成的化合物为蛋白质，包括细胞因子类、基因工程抗体和重组疫苗等；50 或 50 个以下的为多肽，包括疫苗、凝血因子、抗菌活性肽、细胞因子模拟肽及诊断用多肽等。随着生命科学技术的发展，人们对于生命现象、生命本质的探讨和研究不断深入，针对不同作用靶点、信号通路的蛋白多肽类药物相继被开发出来，同时，基因工程技术的发展使得蛋白质多肽类药物的修饰改造及大规模生产已成为可能[4-6]。与传统的小分子药物相比，蛋白多肽类药物，具有药物活性强、用药剂量低、作用特异性高、功能明确、毒副作用小等特点，在免疫功能、信息传导、细胞分泌等方面都显示出了优越的研究作用价值，该类药物已涉及抗肿瘤、抗病毒、靶向治疗、心血管疾病、疾病诊断等方面，引起生命医药科学领域的广泛关注。
随着研究的深入，越来越多的蛋白质多肽类药物投入到临床应用中[12-14]。胰岛素作为第一个蛋白多肽类药物于 1921 年分离获得，并成功应用于Ⅱ型糖尿病的临床治疗[15]。早期研发的蛋白多肽药物主要是激素类药物，如人胰高血糖素、生长抑素、降钙素等[16]，二十世纪 50 年代其研究主要集中于脑垂体分泌的各种蛋白与多肽；60 年代则逐步转向研究由神经细胞分泌的活性蛋白多肽类；70 年代随着阿片样肽的深入研究，神经肽的研究十分活跃，迄今为止人类社会对蛋白多肽类大分子的研究已经十分深入，目前常见的主要有人
胰岛素、人生长激素、干扰素（INF-alpha;、gamma;、beta;）、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子及白介素-2 等，此类药物不仅能够提供人体生长必需的营养，更具有很多的生物学功能，例如防止高血脂、高血压、抗疲劳、延缓衰老、提高机体免疫力、促进微量元素的
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