开题报告内容：
一、研究背景
胸腺是免疫系统中重要的中枢免疫器官,负责T淋巴细胞的分化和成熟 ,其功能的正常与否与机体的健康密切相关。胸腺肽（Thymosin）[1]是胸腺组织上皮细胞分泌的多肽激素，是一种免疫调节剂。胸腺肽alpha;1（Talpha;1）[2]是胸腺肽中具有生物活性的单肽成分，主要是由在胸腺上皮细胞核内进行 DNA 复制和转录的前胸腺素alpha;(ProTalpha;)经酶解而产生[3]。Talpha;1由28个氨基酸组成，分子量为3.108kDa，等电点为4.2，体内N末端乙酰化，序列为CH3CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val -Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH[4]。作为高活性的免疫调节剂，Talpha;1在免疫调节、肿瘤治疗等方面有着重大的作用。Talpha;1的免疫调节作用主要表现在增强T细胞分化与成熟功能，Talpha;1通过激活蛋白激酶C，进入细胞核内激活细胞因子（如IL-6、IL-8）基因转录，介导B7家族成员表达活化，进而通过抗原提呈细胞活化T细胞，激活获得性免疫系统[5]；此外也可通过Toll样蛋白受体信号通道，激活树突状细胞[6]，分泌多种细胞因子参与免疫调节。Talpha;1的抗肿瘤作用主要体现在2个方面[7]，一方面是直接与癌细胞相互作用，促进癌细胞内第二信使花生四烯酸的释放，强烈抑制癌细胞的增殖，另一方面通过促进淋巴细胞的生成，进而调节T细胞亚群的比例，并促进B细胞分化及产生抗体，增强巨噬细胞的吞噬功能，最终改善肿瘤患者的细胞免疫系统功能。目前Talpha;1在肿瘤治疗中已得到广泛应用，包括对非小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤和胃癌等恶性肿瘤的治疗[8]。
因为Talpha;1在体内半衰期很短（lt;2h），为了更好地发挥抗肿瘤效果，延长Talpha;1在体内的半衰期，拟设计一种Talpha;1-Fc融合蛋白。已知免疫球蛋白（Ig）是由2条轻链和2条重链组成的Y型蛋白质，根据重链的类型可将其分为IgG、IgM、IgE、IgA、IgD。IgG是血清中主要的免疫球蛋白，根据IgG中的重链抗原性差异，人的IgG又分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。通过木瓜蛋白酶处理IgG后，可将其分为2个Fab段和一个Fc段。Fc 段即可结晶片段（fragment crystallizable,Fc）[9]，相当于IgG 的CH2和CH3结构域。不同型的Ig的Fc片段可结合不同类型的Fc受体（FcR）从而发挥一定的生物学活性,即IgG（Fcgamma;R）、IgM（Fcmu;R）、IgE（FcεR）、IgA（Fcalpha;R）、IgD（Fcdelta;R）[10]。Fcgamma;R又可分为Fcgamma;RⅠ、Fcgamma;RⅡ、Fcgamma;RⅢ，通常表达于吞噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的表面。此外IgG的Fc段还可和新生儿Fc受体（FcRn）进行结合。Fc与FcRn结合的过程具有pH值依赖性，在pHlt;6.5的条件下，两者形成稳定的复合物，当pH≧7.0时，两者的亲和力以数量级的形式下降，使得复合物分离[11]。当Fc融合蛋白药物进入血液循环时，血管上皮细胞胞外环境不支持FcRn与Fc的结合，Fc融合蛋白药物通过胞吞方式进入细胞，胞吞形成的囊泡发生酸性化，Fc和囊泡膜上的FcRn特异性结合，没有结合FcRn的药物将被细胞内溶酶体降解，结合的药物将避免溶酶体的降解，当再次转运到细胞膜的时候，由于胞外pH为7.4，Fc与FcRn分开，药物又被释放回血液中，这样，通过FcRn所介导的胞吞转运再循环机制可以有效延长Fc融合蛋白的半衰期[12-14]，从而减少用药频率，降低治疗成本。
二、研究目的和意义
本实验拟通过基因工程对Talpha;1与人IgG4-Fc进行融合表达，增加其相对分子质量，避免被肾小球过滤，且Fc段可与体内FcRn结合，通过FcRn所介导的胞吞转运再循环机制有效延长其在体内的半衰期，从而达到减少用药频率的目的。并且通过本次实验探究Talpha;1-Fc的体内抗肿瘤活性。
三、研究内容
研究大致分为以下3个部分：
1. Talpha;1-Fc融合蛋白的重组表达
利用限制性内切酶切割Talpha;1基因、人IgG4-Fc基因及pET32a质粒，通过DNA连接酶制备重组子，转入大肠杆菌BL21菌种，利用pET32a质粒的氨苄抗性进行筛选，将阳性重组菌选出，转入大肠杆菌BL21菌种中，探索最佳诱导条件（诱导剂IPTG或乳糖的最佳浓度以及最佳诱导时间），诱导表达Talpha;1-Fc融合蛋白。
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