开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
keap1-mcherry重组蛋白的表达纯化与验证
吴恒辉
（中国药科大学 药物制剂卓工班）
一、研究目的
Keap1是细胞氧化应激反应中的重要调控因子。当外界的刺激或者有毒物质破坏身体内的氧化还原平衡，细胞就会发生应激反应[1]。近年来对keap1的研究，发现它是一种肿瘤抑制因子，但其作用机制尚不清楚，为一种重要肿瘤蛋白，能通过两种不同的方式引发癌症。 mcherry是一种被广泛用于生物技术作为示踪剂的红色荧光染料，mcherry以及其它大多数红色荧光蛋白是从珊瑚中分离出来的蛋白[2]。把这两个用基因工程重组相当于使keap1表达时直接带上mcherry，随着mcherry基因的诱导表达，重组蛋白检测到明显的红色荧光[9]，就可以直接通过红色荧光检测到这种蛋白。本次研究的目的则是表达纯化与验证keap1-mcherry重组蛋白，掌握重组蛋白诱导表达的方法，并能成功分离高纯度、高活度的keap1蛋白，为了进一步研究keap1的生物学功能奠定基础。
二、文献综述
Keap1是一个含有624个氨基酸的多肽,包含5个功能区域，且与胞浆肌动蛋白相结合,其中含有三个主要的功能区，它们是N末端BTB区、C末端DGR区和一个连接片段(IVR)。IVR含有丰富的半胱氨酸,这被认为对keap1的激活必不可少的。keap1与亲核剂以及氧化剂的反应都发生在IVR区,这亦与IVR区富含有半胱氨酸有关。并且IVR区对于泛素化连接酶的表达形成必不可少，因此其与Nrf2稳定性有关。C末端DGR区含有的六个保守的kelch重复序列，是Keap1与细胞浆内肌动蛋白结合区，也是Keap1与Nrf2的Neh2部位的结合位点。C末端BTB区则与介导Nrf2-Keap1结合有关,BTB区Ser-104突变影响Keap1二聚化,干扰Keap1锚定Nrf2的功能[1]。
在蛋白质表达的过程中,通常需要在目标多肽上融合表达一段标签序列,比如不同颜色的荧光蛋白，以指示目标蛋白的表达[4]。
荧光蛋白作为一种分子标签,在细胞内蛋白质的定位以及动态示踪等方面有着广泛的应用。相较于其他分子标记，荧光蛋白更加易于和目的蛋白融合，对活细胞毒性小，应用更加便利。绿色荧光蛋白(GFP)是最早被发现的荧光蛋白,由日本著名化学家、海洋生物学家下村修从维多利亚水母中首次发现。GFP通过一系列体外分子进化，发展出了多种荧光波长不同、发光强度更高的荧光蛋白，如EGFP(增强型绿色荧光蛋白)、BFP(蓝色荧光蛋白)、CFP(青色荧光蛋白)等。这些荧光蛋白极大地丰富了相应的试验体系和技术。但由于这些荧光蛋白的发射波长均在440-529nm,容易激发胞内物质产生荧光，导致成像时背景较高，限制了这些荧光蛋白的应用。
mcherry是一种被广泛用于生物技术作为示踪剂的红色荧光染料，包括分子的标记和细胞组分的定位等。不同于其它从维多利亚水母中分离的GFP蛋白和其它绿色荧光蛋白变体，mcherry以及其它大多数红色荧光蛋白是从Discosoma菌种中分离出来的蛋白。mcherry因为其颜色和单体分子的光稳定性，比其它荧光蛋白标签更优异，其最大激发光和发射光分别为587nm和610nm。红色荧光蛋白作为一种分子标签,在蛋白质的细胞内定位等方面有着广阔的应用前景。与其他胞内蛋白质定位的方法相比,构建红色荧光蛋白融合表达载体具有耗时短、易于观察目的蛋白、操作简便、不影响细胞活性等优点[2]。
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