海洋微生物的可培养研究文献综述

一、课题解决的问题

海洋微生物是海洋生命中最丰富的类群，从最深的海沟到最高潮间带均有分布，且种类多种多样，不断有新种被鉴定出来。虽然海洋微生物包含了那些最小和结构最简单的类型，但其在生物进化中扮演了重要角色，不仅目前所知的生命起源于微生物，地球其他的生命形式与依赖于它们，在海洋食物链中发挥了巨大作用^[1]。

对不可培养微生物的培养一直是微生物领域的研究热点和难点。活的但非可培养(viable but non-culturable，VBNC)状态是非芽孢形成菌抵御不良环境的生存机制^[2]。VBNC 状态广泛存在于已培养和未可培养的微生物中，它是在特定条件下，微生物不可分离培养的一种状态。据报道，99%以上的微生物因处于VBNC状态而无法分离培养^[3]。因此，研究VBNC状态形成及复苏对于揭示不可培养微生物的存在机理具有重要意义。

在过去的30年中，细菌16S rRNA基因文库构建和序列分析、变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)、DNA芯片技术、高通量测序、宏基因组学等分子生物学技术成为解释微生物多样性的巨大推动力，许多新的物种通过16 S rRNA测序和宏基因组等分子生物学方法被发现^[4-5]，从而使人们更加明确地了解可培养微生物与已被鉴定的微生物之间的差距。这不仅大大丰富了微生物的多样性数据，同时也从遗传物质的角度提供了自然环境中微生物的生理生化等功能信息，使我们更加清晰地认识到未培养微生物不仅蕴含着丰富的基因、系统发育学和生态学信息，更是人类亟待开发利用的庞大生物能源库。

分析技术的进步并不能一蹴而就地解决目前存在的所有问题，如GenBank中的现有基因大多数没有明确的功能注释，无法准确地了解单一微生物在环境中的生理代谢特性，无法为获取目标微生物的可培养提供足够的信息支持。分子水平的生物学信息限制了种群水平上微生物形态、代谢途径及其在环境中作

用的深入研究。因此，在分子生物学技术持续发展的同时，仍需不断开发新的微生物培养技术，不仅增加可培养微生物在环境中的比例，更重要的是为理解微生物在环境中的行为与功能，实现微生物资源的利用与扩大化奠定扎实的理论与科学基础^[6]。

1. 研究方法和技术路线

研究方法：

①分散与差速离心法：

差速离心通过逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

经过多次不同条件的分散和差速离心，从沉积物样本中分离得到混合细菌悬液。

②夹心培养基：

Burmolle 设计了一种含有夹层菌的培养基，即先倒一层培养基，凝固后涂布一层细菌，待干后再倒一层一样的培养基，利用这种培养基对土壤微生物进行分离，能得到高于普通培养基20%-40%的菌落数，16S rRNA测序结果表明有许多可能的未知新种。

技术路线：

三、国内外研究现状

海洋占整个地球表面积的70%，其中蕴藏着丰富的海洋微生物资源，是21世纪亟待开发和利用的巨大宝藏。海洋中存在着许多自然条件特殊的环境，如低温、高温、高压、高盐、强酸、低营养和低浓度溶解氧等环境，一般的海洋生物无法在其中生存，只有某些具备特殊生理和遗传特性的微生物，如嗜冷微生物、嗜压微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、寡营养微生物和嗜热古细菌，才可以在这类环境中生长和代谢，因而在物种、基因组成和生态功能上具有多样性，是整个生物多样性的重要组成部分。

海洋微生物不仅在海洋生态环境保护、地球物质循环和能量转换等方面具有非常显著的作用,而且能够为人类提供种类繁多、分子结构新颖、化学组成复杂和生理活性特异的海洋天然产品,是海洋药物、保健食品和生物材料的巨大宝库。因此保护和拯救海洋微生物多样性是实现人类可持续发展的基础。

目前，很多研究者认为由于大量不可培养微生物的存在，应用纯培养技术不能准确反映环境中微生物的多样性。自1985年Pace等利用核酸序列的测序来研究微生物的进化问题以来，对微生物多样性的研究便进入了一个崭新的阶段。采用聚合酶链式反应(PCR)、16SrRNA 序列分析以及ARDRA(Amplified rDNA Restriction Analysis)等现代分子生物学技术在基因水平上研究海洋微生物多样性，这样可以克服微生物培养技术的限制，能够对样品进行比较客观的分析,较精确地揭示海洋微生物的多样性。因此，近20年来对微生物多样性的分析从纯培养技术转向了基于16S rDNA 序列的免培养分析法，这类方法的应用，使人们发现了很多新的不可培养微生物类群。但免培养分析法也存在诸多不可忽视的局限性，如不易获取环境样品中所有微生物的DNA、不易同时等量PCR扩增各类微生物的16S rDNA 等。另外，仅根据16S rDNA序列相似性，并不能很准确地确定微生物的分类地位。微生物只有得到纯培养并结合其它特征分析后才能确定其分类地位，不可培养微生物尤其如此。因此，纯培养方法仍然是分类学、生态学、生理学，以及次生代谢产物化学研究的有效方法。

不可培养微生物又被称为未被培养微生物，它是针对可被纯培养微生物来说的一种相对性概念^[7-8]。早于 1898 年，样品中微生物细胞数与固体培养基上所形成的菌落数之间存在差异的现象已被研究报道^[9]。1911 年，Amann 对这种差异进行了量化处理，并且估计出不可培养的细胞数约是可培养细胞数的 150 倍^[10]。随后，Staley 和 Konopka在前人的研究基础上发现了“平板计数

巨大异常(great plate count anomaly)”这一重要现象，该现象揭示了平板菌落计数与实际细胞计数之间的差异^[11]。随着分子生物学的发展，越来越多的不可培养微生物利用测序手段被发现^[12]。微生物不可培养的原因较为复杂，如个别微生物由于生长速度极慢或菌落极小而导致其无法短期生长至肉眼可见的水平^[13]。

Burmoslash;lle设计了一种夹层菌技术，并在实验中证实，包埋菌株的存在并未产生有利于分离特定遗传系统菌种的选择性，但是获得了更多的新型分离株。因此，这种方法是对传统琼脂平板培养的一种可行且合理的替代方法或补充方法。此外，该设计可用于测试特定基因产物（例如抗生素，信号分子）对可培养细菌群落的影响^[8]。

四、研究内容

第一部分，绪论与综述。提出本文研究的背景与意义，分析国内外研究状况。

摘要(Abstract)，引言(Introduction)。

1. 实验。根据具体实验，撰写实验报告，包括材料与方法、实验结果与分析、讨论。

材料与方法(Materials and methods)，实验结果与分析(Results and conclusion)，讨论(Discussion)。

1. 展望(Prospect)。
2. 参考文献(References)。

参考文献：

1. Peter Castro, Michael E.Hunber. Marine Biology[6th edition], 2007
2. Pinto D, Santos MA, Chambel L. Thirty years of viable but nonculturable state research: Unsolved molecular mechanisms. Critical Reviews in Microbiology, 2015, 41(1): 61–76.
3. 张硕. 微生物 VBNC 状态形成及复苏机制. 微生物学报Acta Microbiologica Sinica 2018, 58(8): 1331-1339
4. Narihiro T, Kamagata Y. Cultivating yet-to-be cultivated microbes: the challenge continues [J]. Microb Environ, 2013, 28 (2): 163-165
5. Ravin N, Mardanov A, Skryabin K. Metagenomics as a tool for the investigation of uncultured microorganisms [J]. Rus J Gen, 2015, 51 (5): 431-439

1. 范念斯. 未培养微生物的培养方法进展. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2016，22(3) : 0524-0530
2. Epstein SS. Microbial awakenings. Nature, 2009, 457(7233): 1083.
3. Epstein SS. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology, 2013, 16(5): 636–642.
4. Winterberg H. Zur Methodik der Bakterienzauml;hlung. Zeitschrift fuuml;r Hygiene und Infektionskrankheiten, 1898, 29(1): 75–93.
5. Amann J. Die direkte Zauml;hlung der Wasserbakterien mittels des Ultramikroskops. Centralbl Bakteriol, 1911, 29: 381–384.
6. Staley JT, Konopka A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annual Review of Microbiology, 1985, 39(1): 321–346.
7. Vartoukian SR, Palmer RM, Wade WG. Strategies for culture of lsquo;unculturablersquo; bacteria. FEMS Microbiology Letters, 2010, 309(1): 1–7.
8. Eichorst SA, Breznak JA, Schmidt TM. Isolation and characterization of soil bacteria that define Terriglobus gen. nov., in the phylum Acidobacteria. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(8): 2708–2717.