开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
端粒酶是一种特别的核糖核蛋白，可以增加端粒末端的重复序列，以维持连续的细胞增殖[1]。研究发现端粒酶在85-90％的人癌细胞中表达，端粒酶通过避免端粒的缩短，使得癌细胞无限分裂。而相比之下，端粒酶在正常细胞中几乎不存在[2, 3]。由于端粒酶活性在肿瘤细胞及正常细胞中具有如此明显的区别，并且有研究发现端粒酶的活性高低与肿瘤的分化程度密切相关[4]，因此，端粒酶的检测对于癌症诊断及预后都具有重要的意义。
近年来，端粒酶活性检测方法不断发展，为癌症的诊断治疗提供了许多新思路和新途径。目前端粒酶活性检测的方法主要有：（1）端粒重复序列延伸法 （2）TRAP法 （3）改良的TRAP法 （4）间接检测法。其中，端粒重复序列延伸法作为基本方法，灵敏度较低，所需样本量大，并不实用。TRAP法应用了PCR技术对端粒酶合成的端粒DNA进行扩增，大大提高了灵敏度和速度，但却属于定性检测，对活性程度的判断较困难，而且使用的放射性同位素标记具有一定的危险性。改良的TRAP法是在TRAP法的基础上，分别从几个方面进行改进，目前主要有五种方法可直接检测端粒酶活性，比较灵敏，迅速且重复性好。间接检测法包括原位杂交，逆转录-聚合酶链反应和免疫组化法，其准确性仍有待进一步的研究。但是细胞中端粒酶的活性并不能从以上这些方法完全定量检测出来。
分子信标技术是一种基于荧光共振能量转移建立的分析技术，近年来，因为分子信标具有高灵敏度、高特异性、操作简单等优点，被广泛的应用于生物学的分析领域[5-10]。分子信标一般有三个部分组成，包括猝灭基团、荧光基团以及对待检测物敏感的连接核酸序列。而金纳米粒子是一种可以代替传统猝灭基团的新型猝灭剂[11-16]，常常用于FRET系统中的猝灭剂。研究发现金纳米粒子作为FRET的能量受体有很强的荧光猝灭效率和稳定的光学性质，且易于修饰标记。因此，金纳米粒子非常适合用作荧光共振能量转移系统中的猝灭剂，具有很好的应用前景。端粒酶作为肿瘤标志物中的一种，利用分子信标快速进入细胞质中，产生荧光信号，进而可以无损、实时地监测活细胞内的端粒酶活性，同时还发现分子信标产生的荧光强度与端粒酶活性具有非常好的线性关系，可以用于相对定量细胞内的端粒酶活性。通过构建基于金纳米粒子的端粒酶活性检测分子信标，将分子信标应用于活细胞内无损实时的检测端粒酶活性，从而达到区分正常细胞和肿瘤细胞的目的。
- 要解决的问题
- 合适粒径的金纳米粒子的合成。金纳米粒子作为FRET的能量受体具有很强的荧光猝灭效率。1.4nm粒径的金纳米粒子的猝灭能力可以达到传统猝灭剂的100倍。而粒径大于5nm的金纳米粒子则具有很强的表面离子共振的光学性质。
- 端粒酶响应型金纳米粒子分子信标的设计。对于合成的金纳米粒子表面进行修饰，以金纳米粒子为该分子信标的基质及猝灭剂，更有利于其在活细胞内的检测，用于区分正常细胞和肿瘤细胞。
- 金纳米粒子以及分子信标的表征。通过表征对以上合成物进行分析鉴别，继而对合成物进一步的应用。
- 如何模拟细胞内环境。由于该分子信标是应用于活细胞内的实时在位监测，所以有必要模拟细胞内环境。
- 监测端粒酶分子信标的方法设计。这为此分子信标能否在活细胞内进行响应提供了基础。
- 可行性分析
金纳米粒子可通过基本的柠檬酸钠还原法制得，而合成物的表征可通过紫外吸收光谱、水合粒径监测及电镜扫描的方式进行分析。在分子信标中加入细胞内代表性的核酸相关酶及还原性物质能有效的模拟细胞内环境。
- 研究方法和内容
(1) 端粒酶荧光分子信标的合成。采用柠檬酸钠还原法合成直径为15nm 的金纳米粒子，再将活化好的Seq1 序列、TP 序列（发卡型双链DNA）与金纳米粒子溶液混合，之后向体系中加入聚乙二醇（PEG）提高金纳米粒子的稳定性，然后分批加入Tween-20 及氯化钠溶液，最后反应产物用离心机沉淀，并用PBS 重悬离心后沉淀的分子信标。
(2) 端粒酶荧光分子信标的表征。主要是通过使用紫外分光光度计检测其扫描吸收光谱，波长范围在200-700nm，步长为1nm。并用激光动态光散射粒度分析仪来考察分子信标的水合粒径及粒径分布，使用高分辨率透射电镜观察分子信标的形貌特征。
(3) 实时监测细胞内端粒酶的活性。将合成的端粒酶分子信标用含有dNTP的PBS缓冲液稀释，分装四组等量的分子信标，再将DNase I，T4 DNA Ligand 以及GSH等细胞内代表性的核酸相关酶及还原性物质分别加入到分子信标AuNPs-MB 中，其中一组用荧光分光光度计检测分子信标中金纳米粒子对荧光素的猝灭效果，剩余三组加入等浓度端粒酶，分别在0，0.5，1，1.5 和2 小时后检测分子信标的荧光恢复情况。
- 工作计划
2月28日—3月17日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。
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