开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景
PD-1或CD279，作为体内重要的一个免疫检查点，是一种在人体中活化的T细胞的表面上表达的蛋白，由PDCD1基因编码。当其配体PD-L1或PD-L2结合免疫细胞表面上的PD-1时，T细胞会失去活性，这是肿瘤中形成免疫逃离的重要机制。许多肿瘤细胞表达PD-L1，能够与在肿瘤微环境中的抗原特异性T细胞产生的PD-1结合。大多数情况下，PD-L1是人类癌症过程中主要的PD-1配体。效应性淋巴细胞上PD-1及肿瘤细胞、肿瘤相关免疫细胞上的PD-L1的表达是免疫反应的指征，但是，临床表观病变研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞TIL的稳态功能不足以控制疾病的发展。因此，靶向PD-1或PD-L1阻止他们之间受体/配戏相互作用的治疗性单克隆抗体能够释放T细胞的功能，使其在肿瘤抗原特异性免疫反应中重新起效。
目前，单克隆抗体在抑制此通路中已经显示出了良好的临床活性，但是它们还是具有严重的免疫相关不良反应。因此，为了解决单抗的这些限制，一些其他类型的蛋白药物如肽治疗剂或新型支架蛋白的研究正逐步提上日程。新型支架蛋白在生理性质方面具有优于抗体的特性，因此能够取代抗体并应用于更大的范围。首先，支架蛋白不易聚集，因此不仅便于有效地进行筛选，还能进行几乎所有的体外应用。其次，许多应用中需要进行化学偶联，比如说荧光基团、毒素、纳米颗粒或者固相载体，支架蛋白能够设计成只拥有唯一一个半胱氨酸的形式，将大大方便这些过程。第三，在大肠杆菌细胞质中表达功能性蛋白的一个先决条件就是没有二硫键，大肠杆菌中正确进行折叠才能进行蛋白功能研究。这一点上，可以对支架蛋白进行合理设计避免二硫键。第四，具有可多价或者多特异性结合蛋白的特点是增加亲和力或者交联不同表位的一个前提条件，支架蛋白正具有这一特点。第五，支架蛋白能够形成良好的融合蛋白而不造成聚集。第六，支架蛋白便于设计延长体内半衰期，比如说位点特异性地PEG修饰或者融合一个能够结合长半衰期的血清蛋白的结构域。
DARPins (Designed Ankyrin Repeat proteins) 蛋白是基因工程抗体类似蛋白，为一类设计的锚蛋白重复序列蛋白，锚蛋白重复序列蛋白本身即在人体内广泛存在，其天然的生物学功能为与靶蛋白结合，产生生物学激活或抑制效应。它的特征在于其是由20-50个氨基酸组成的小的重复结构模体，重复模体的数量与结构在不同的蛋白家族中不尽相同。这些模体或者重复结构顺序排列堆叠，形成了长条状的稳定结构，并具有很大的表面积——与典型的球状蛋白相比，这就是潜在的巨大的结合区域。这个长条的结构是由重复蛋白之内或者之间的疏水作用及氢键来稳定的。许多重复结构的N端和C端还有特殊的重复序列形成一个亲水表面，像帽子一样保护疏水内核。这种结构可以让蛋白拥有以一种特定的方式去结合多种配体的无限可能。同时，蛋白所具有的的伸展的刚性表面在结合靶点时几乎不损失熵。以上几点使重复蛋白家族能提供一个便于设计的大型文库用于筛选高亲和力蛋白。在前期的研究中，本课题组已经筛选出了一种能够靶向PD-L1结合的DARPins分子，该蛋白能够在体外与PD-L1进行结合，经流式验证与细胞表面高表达的PD-L1也能够结合，本文将对其相关的药理活性做初步探究。
- 研究目的和意义
本课题对前期筛选制备得到的DARPin分子进行初步的药理药效学研究，并进一步对其抑瘤活性进行研究。确定蛋白对细胞的杀伤性及血浆半衰期，通过小鼠结肠癌同基因型模型研究蛋白在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果及对体重的影并且对药物的靶向作用及传送效率进行初步研究。
- 实验内容
1. DARPin蛋白的药学性质鉴定
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- DARPin蛋白对细胞杀伤性研究
通过MTT实验考察蛋白对小鼠结肠癌细胞CT26的细胞毒性，在酶标仪上测量OD490nm处各孔的吸光度。计算细胞存活率，考察不同浓度的蛋白对CT26细胞的杀伤作用。
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- DARPin蛋白的血浆半衰期检测
通过在Balb/c小鼠中尾静脉给药10 mu;g 蛋白，分别在0 min、3 min、10 min、30 min、60 min、120 min时间点眼眶取血采取小鼠血样，通过ELISA方法检测蛋白血浆半衰期，参考文献半衰期设计给药方式与给药时间。
2. DARPin蛋白在荷瘤小鼠体内的性质
2.1 DARPin蛋白在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果
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